Cathepsin B-induced cleavage of collapsin response mediator protein-2

Abstract

Collapsin response mediator protein-2 (CRMP-2)는 신경에서 axon guidance나 neuronal outgrowth와 관련하여 중요한 역할을 하는 단백질로 알려져 있다. PC12 세포를 이용한 실험에서 CRMP-2는 허혈 상태를 유발시켰을 때 calpain에 의해 58 kDa의 단백으로 잘리는 현상이 관찰되었다. 그러나 이전 연구에서 이러한 CRMP-2의 절단 현상이 calpain이 아닌 다른 신호전달 경로를 통해 일어날 수도 있음이 시사되었다. 이번 연구에서는 우선 다른 신경 세포나 glial 세포에서도 CRMP-2의 절단 현상이 나타나는지 관찰한 후, 허혈 상태에서 CRMP-2의 변형에 관여하는 다른 protease들이 있는지 조사되었다. Cerebral ischemia는 뇌세포에 당과 산소가 불충분하게 공급됨으로써 유발되는데 신경 세포 사멸을 통해 회복 불가능한 뇌 손상을 야기한다. Cerebral iscehmia가 일단 시작된 후에는 cathepsin, calpain 또는 caspase 같은 cysteine protease들이 빠르게 활성화되면서 여러 가지 경로로 세포 사멸이 발생한다. 그 중에서도 활성화된 calpain과 cathepsin B는 cerebral ischemia가 발생하는 동안 necrosis나 apoptosis 같은 세포 사멸을 유발한다. 최근 CRMP-2의 level이 현저히 증가한 ischemic hemisphere의 피질 부분에서 catheopsin B의 활성이 증가한다는 보고는 있지만 CRMP-2와 cathepsin B와의 연관성에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 이번 연구에서는 cathepsin B의 농도 증가에 따라 CRMP-2가 단계적으로 절단되는 현상이 처음으로 발견되었으며 이는 CRMP-2가 cathepsin B의 기질이라는 것을 나타낸다. 하지만 허혈 상태로 유발되는 CRMP-2의 절단은 cathepsin B와는 무관하게 나타나며 허혈 상태로 인한 세포 사멸의 기전에도 cathepsin B가 큰 영향을 미치지는 않는 것으로 나타났다. Cathepsin B에 의한 CRMP-2의 절단 부위는 calpain에 의해 잘릴 것이라고 예측되는 절단 부위와 비교되었다. 우선 calpain에 의한 CRMP-2의 정확한 절단 부위를 확인하기 위해서 calpain에 의해 절단될 것으로 예상되는 부위에서 절단된 세 가지 mutant한 CRMP-2 cDNAs(CRMP-2/1-532, CRMP-2/1-499, CRMP-2/78-572)를 만들어 V5 tag을 단 construct를 제조하였다. 이를 HEK293 cell에 transfection 해 본 결과 calpain에 의해 절단된 CRMP-2의 size와 cathepsin B에 의해 처음 절단된 CRMP-2의 size가 거의 비슷한 것으로 관찰되었다. Cathepsin B에 의해 두 번째로 절단된 CRMP-2의 size는 CRMP-2/1-499의 size와 비슷한 것으로 나타났다. 후속 연구에서는 calpain과 cathepsin B에 의해 절단되는 CRMP-2의 위치를 정확히 밝히고 절단된 각각의 CRMP-2가 허혈 상태의 세포 사멸 기전에서 어떤 역할을 하는지 규명되어야 할 것으로 사료된다.;Previously, it was demonstrated that collapsin response mediator protein-2 (CRMP-2) involved in axonal guidance and neuronal outgrowth, is specifically truncated into 58 kDa form by calpain under ischemic condition in PC12 cells (Chung et al., 2005). Previous study also suggested that other pathway is existed which regulates the cleavage of CRMP-2 independent of calpain. In this study, first, it was examined that whether the cleavage of CRMP-2 also occurs in other neuronal or glial cells. And it was next examined if other proteases are involved in the alteration of CRMP-2 under ischemic condition. Cerebral ischemia causes irreversible brain damages which can be attributed to neuronal cell death resulting from an insufficient supply of glucose and oxygen to brain tissue. There are numerous biochemical pathways that lead to cellular death after onset of neuronal ischemia rapidly activating cysteine proteases including the cathepsins, calpains and caspases. Among them, activated calpain and cathepsin B mediates necrotic and apoptotic cell death independent or dependent of caspases during the transient focal cerebral ischemia. Even though recent studies have found that activity of cathepsin B increased predominantly in the subcortical region of the ischemic hemisphere where the levels of CRMP-2 significantly elevated, the relation between cathepsin B and CRMP-2 is mostly unknown. In the present study, it was first found that CRMP-2 undergoes stepwise cleavage by cathepsin B in a dose dependent manner in PC12 cells, indicating that CRMP-2 is one of substrate of cathepsin B. However, it was shown that ischemia-induced CRMP-2 cleavage occurred independent of cathepsin B. Cathepsin B also did not have any significant effects on cell viability during ischemic condition. The cleavage sites of CRMP-2 induced by cathepsin B were compared with several putative cleavage sites of CRMP-2 induced by calpain. Constructs of the V5 tagged-CRMP-2 mutant cDNAs, truncated at putative calpain cleavage sites, were produced to confirm the exact cleavage site induced by calpain. Using transfection experiments, it was found that the first product size of CRMP-2 which was cleaved by cathepsin B was similar to the size of truncated CRMP-2 induced by calpain. The second product size of CRMP-2 cleaved by cathepsin B was similar to that of other putative calpain cleavage site which was expected in studies reported by other researchers. The exact sites of CRMP-2 truncated by calpain or cathepsin B and the roles of the cleavage forms of CRMP-2 in cell death signaling under ischemic condition need to be further investigated in the future study.