Changes of sAPPα release by different amyloid beta assemblies

Abstract

The amyloid precursor protein (APP) is a transmembrane protein that produces amyloid-β (Aβ) peptide, found in the brains of Alzheimer’s disease (AD). APP normally undergoes proteolytic cleavage within the Aβ sequence by α-secretase, liberating a soluble N-terminal fragment (sAPPα) which can promote neuronal cell survival. A disintegrin and metalloproteinase (ADAM) family, ADAM 10 and ADAM 17, also called tumor necrosis factor-α converting enzyme (TACE) are candidate proteins for α-secretases. ADAM 10 is known to be largely responsible for the constitutive basal α-secretase activity, whereas the protein kinase C-stimulated α-secretase activity is attributable to ADAM 17. The Aβ can exist in diverse assembly states. Major issue in the toxicity of Aβ in recent days is the pathophysiological role of the different aggregation species. Both oligomeric as well as fibrillar Aβ have been reported to be toxic, but oligomeric Aβ do so more potently. The mechanism of Aβ neurotoxicity is unknown and still disputed. There have been several mechanisms for Aβ toxicity relate induction of oxidative stress, interaction with cell-surface receptors and resulting in inhibition or aberrant activation of signal transduction pathways, increase in membrane permeability and intracellular calcium concentrations. Although oligomeric and fibrillar Aβ potentially contribute to AD, the role of oligomeric and fibrillar Aβ remains controversial. It has been reported from many studies about APP processing and Aβ production, but direct relation between sAPPα release and different forms of Aβ has not been investigated. The purpose of this study was to investigate whether the differently assembled forms of Aβ_(1-42) have effects on the neuronal cell viability and the release of sAPPα. To pursue the purpose, unaggregated, oligomeric and fibrillar Aβ_(1-42) prepared at different conditions were identified. Formation of oligomeric assemblies with sizes ranging from 30 to 120 kDa was confirmed. Aβ_(1-42) showed different conformation from unaggregated (< 20 kDa) and the fibrillar form which was detected as aggregates with very high molecular weight over 220 kDa. Then cell viability was measured in human neuroblastoma SH-SY5Y cells to determine the toxic effect of unaggregated, oligomeric and fibrillar Aβ_(1-42). Cell viabilities were not significantly decreased by all forms of Aβ. To find a reason for non toxic effect of Aβ_(1-42) on SH-SY5Y cells, whether the release of sAPPα which is known to be neuroprotective changes in response to oligomeric and fibrillar Aβ_(1-42) was tested. It was found that sAPPα release was significantly enhanced by oligomeric Aβ_(1-42) in a concentration-dependent manner. On the other hand, it was not changed by unaggregated form and fibrillar Aβ_(1-42) with an exception of a reduction of sAPPα release at a highest concentration (10 μM). The unaggregated and fibrillar Aβ_(1-42) produced no significant changes in both the expression of ADAM 10 and ADAM 17. The oligomeric Aβ_(1-42) showed a tendency to increase in ADAM 10 expression levels in concentration-dependent without changes in ADAM 17. These results represent a possibility that oligomeric Aβ increase sAPPα release through ADAM 10 although no evidence for the α-secretase activity was provided. Results also indicate that no toxic effect of oligomeric Aβ_(1-42) treatment may be due to an increase in sAPPα release by oligomeric Aβ_(1-42). A CCE inhibitor, SKF96365, significantly inhibited the sAPPα release enhanced by oligomeric Aβ_(1-42). It could be speculated that extracellular Ca^(2+) through a CCE is possibly involved in stimulation of sAPPα release by oligomeric Aβ_(1-42). The intracellular transduction pathways which can connect diverse Aβ assemblies and alteration of sAPPαrelease need to be further elucidated, in future studies.;아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursor protein: APP)은 내재성 막 당 단백질로서, 대사과정 중 아밀로이드 베타 또는 에이베타 (amyloid β: Aβ)를 생성한다. Aβ는 기억력 저하, 인지능력 저하, 주의력 저하, 사고력 저하와 판단력 저하 등의 임상적 증상과, 대뇌피질과 해마 또는 편도핵에서 neurofibrillary tangle과 senile plaque이 병리학적 증상을 나타내는 신경퇴행성 질환의 일종인 Alzheimer disease (AD)에 있어서, 학습과 기억 능력에 손상을 주는 요인으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 이에 반해, 정상적인 세포에서 APP의 대사 과정 중에 알파 분비효소 (α-secretase)에 의해 잘려져 생성되는 용해성 아밀로이드 전구단백질 (soluble amyloid precursor protein: sAPPα)은 세포 밖으로 분비되어 세포의 생존, 증식과 부착을 조절하며 신경돌기의 발아 후 생육을 유도한다. 비내재성 금속 단백질 가수분해 효소 (a disintegrin and metalloproteinase: ADAM) 중에 ADAM 10과 암세포 괴사 인자 알파 전환 효소 (tumor necrosis factor-α converting enzyme: TACE)라고도 불리우는 ADAM 17이 α-secretase를 나타내는 대표적인 지표 단백질이다. ADAM 10은 정상상태에서의 기본적인 α-secretase의 활성과 관련이 있고, ADAM 17은 단백 키나아제 씨 (protein kinase C: PKC)에 의해 자극되는 α-secretase의 활성과 관련이 있다. Aβ는 여러가지 다양한 뭉침 상태로 존재할 수 있다. 근래 Aβ 독성의 주요 쟁점은 서로 다르게 뭉쳐진 종류의 병태생리학적 역할이다. 저중합체 (oligomeric) 상태와 섬유 (fibrillar) 상태 모두 독성이 있으나, oligomeric Aβ가 더 강하다고 보고되어 왔다. Aβ의 신경독성의 기전은 잘 알려져 있지 않고 여전히 논쟁 중인데, 이제까지 논의된 몇몇 기전들에는 산화성 스트레스의 유도, 세포막 수용체와 반응하여 신호 전달 과정의 활성화 또는 억제화, 막 투과율과 세포내 칼슘 농도 증가 등이 있다. Oligomeric와 fibrillar의 Aβ 모두 AD에 관여한다 할지라도, 각각의 역할에 대해선 여전히 알 수 없다. 많은 연구들이 아밀로이드 전구단백질 과정과 Aβ 생성에 대해 보고해왔지만, 직접적으로 sAPPα의 분비와 다양한 형태의 Aβ에 대해서는 연구된 바 없다. 본 연구의 목적은 신경세포에서 독성자극에 반응하여 신경 보호 작용을 나타내는 sAPPα의 분비에 서로 다른 뭉침 상태의 Aβ가 영향을 미치는지 알아보려고 하였다. 이러한 목적을 수행하기 위하여 서로 다른 조건 하에서 만들어진 비뭉침 상태, oligomeric, fibrillar의 Aβ를 확인할 수 있었다. Oligomeric의 Aβ는 30에서 120 kDa의 범위에서 확인되었다. 비뭉침 상태의 Aβ는 20 kDa 아래에서, 고분자량으로 뭉쳐진 fibrillar의 Aβ는 220 kDa 이상에서 보였다. 다음으로 인간 신경아세포종 SH-SY5Y 세포의 생존율을 측정해보았다. 서로 다른 뭉침 상태의 Aβ 모두 세포의 생존율 변화에는 그다지 큰 영향을 미치지 않았다. Aβ가 SH-SY5Y 세포에 독성을 나타내지 않는 이유를 밝히기 위해, 서로 다른 뭉침 상태의 Aβ에 의해 sAPPα가 분비되는지 실험해보았다. Oligomeric Aβ에 의해 sAPPα의 분비가 농도의존적으로 현저하게 증가하는 반면, 비뭉침 상태와 fibrillar Aβ에 의해서는 변화가 없었으며, 예외적으로 fibrillar Aβ에서 가장 높은 농도 (10 μM)에서는 sAPPα의 분비가 감소하였다. 또한 비뭉침 상태와 fibrillar Aβ는 ADAM 10과 ADAM 17의 발현 모두 크게 변화시키지 않았다. Oligomeric Aβ의 경우 ADAM 10은 농도에 따라 증가하는 양상을 보였으나 ADAM 17은 큰 변화를 보이지 않았다. 비록 α-secretase 활성에 대한 증거는 제공되지 않았지만, 이러한 결과는 oligomeric Aβ가 ADAM 10을 통하여 sAPPα의 분비를 증가시킨다는 것을 제시할 수 있다. 또한 oligomeric Aβ가 독성을 나타내지 않는 이유도 sAPPα 분비의 증가 때문이라고 할 수 있을 것이다. 용량성 칼슘 유입 (capacitative calcium entry: CCE) 저해제인 SKF96365는 oligomeric Aβ에 의해 증가되었던 sAPPα의 분비를 현저하게 감소시켰다. 이것은 세포 내 칼슘이 CCE를 통해 들어와 oligomeric Aβ에 의한 sAPPα 분비 증가에 관여한다고 말할 수 있겠다. 이 밖에 다양한 Aβ assembly와 sAPPα 분비 조절에 관련된 세포 내 전달 과정에 대하여 앞으로 더 연구가 되어야 할 것이다.