Daphnane diterpenes의 사람 폐암 세포에 대한 성장 저해 및 작용기전에 관한 연구

Abstract

현대인의 생명을 위협하는 가장 심각한 질환인 암은 암의 예방과 조기진단 및 치료에 많은 노력을 기울임에도 불구하고 그 발생률 및 사망률이 매년 증가하고 있다. 그 중에서도 암으로 인한 사망률 1위를 차지하고 있는 폐암은 다른 암에 비해 치료가 쉽지 않아 새로운 치료제를 개발하기 위한 연구가 절실히 필요한 실정이다. 이에 따라 본 연구에서는 원화 (flowers of Daphne genkwa)에서 분리된 daphnane diterpenoid인 yuanhualine (YL), yuanhuahine (YH), yuanhuagine (YG)의 사람 폐암 세포 성장 억제 효과 및 그 작용기전에 대해 실험을 수행하였다. 그리고 기존 항암제에 내성을 갖는 내성세포주의 성장 억제 효능 및 기존 항암제와의 병용처리에 따른 암세포 성장 저해 활성도 살펴보았다. YL, YH, YG를 사람 폐암 세포인 A549 세포에 농도별로 72시간 처리한 결과 각각 7.0, 15.2, 24.7 nM의 IC_(50)값을 나타냄으로써 우수한 세포 성장 억제 효능을 확인할 수 있었다. 이들의 암세포 성장 저해 작용기전을 알아보기 위하여 fluorescent activated cell sorter (FACS) 분석법을 이용한 세포주기조절을 확인한 결과 YL, YH, YG에 의해 A549 세포의 G0/G1기와 G2/M기의 세포주기의 진행이 억제됨을 알 수 있었다. 세포주기 관련 단백질의 조절을 확인하기 위하여 western blot법을 수행한 결과 YL, YH, YG는 cdk4와 cMyc 및 Rb의 발현을 감소시키고 p53와 p21을 증가시킴으로써 G0/G1기의 진행을 억제하며 cyclin B1와 cdc2의 감소를 통하여 G2/M기의 진행을 억제시킴을 확인할 수 있었다. 그리고 물질 처리군에서 종양억제인자인 PTEN의 발현이 증가하였고 세포증식에 직?간접적인 영향을 미치는 Akt, Stat3, src는 발현억제를 나타내었다. 따라서 이들 물질은 폐암세포의 G0/G1기 및 G2/M기의 세포주기뿐만 아니라 여러 세포 신호 전달 과정을 조절하여 암의 증식을 저해하는 효능을 갖는 것으로 여겨진다. 다음으로 YL, YH, YG를 이용하여 기존 항암제에 대한 내성을 갖는 세포주에 대한 성장 저해 활성을 살펴보기 위하여 gemcitabine에 내성을 갖는 A549 세포 (A549-gem)에 대한 활성을 확인한 결과 YL, YH, YG는 기존 A549 세포에서의 결과와 유사한 9.4, 15.2 24.3 nM의 IC_(50)를 나타냄으로써 이들 물질은 gemcitabine 내성 세포주에도 우수한 암세포 증식 저해 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 이외에 폐암에 대한 표적항암제로 개발된 gefitinib 및 erlotinib의 내성 폐암세포주 (H292-gef, H292-erl)에서도 본 실험물질은 매우 우수한 암세포 성장 저해 활성을 나타내는 것으로 나타났다. 따라서 이를 통해 YL, YH, YG는 기존 항암제에 내성을 갖는 여러 내성세포주에 대해서 효과적인 암세포 성장 억제 효능을 갖는 것으로 생각된다. 본 시험물질 중 가장 활성이 높은 YL을 이용하여 A549 세포에 대하여 기존 항암제 (gefitinib, erlotinib, sorafenib, sunitinib, gemcitabine)와 병용처리를 하여 암세포 성장 저해 활성을 확인한 결과 YL은 gefitinib, erlotinib, sunitinib, gemcitabine에 대하여 암세포 성장 저해 활성의 상승 효과 (synergy effect)를 갖는 것으로 확인되었다. 결과적으로 daphnane diterpenes인 YL, YH, YG는 폐암 치료제의 개발에 있어 새로운 후보물질이 될 수 있을 것이라 여겨진다.;Despite the immense efforts into cancer prevention, early diagnosis, and treatment, it seems that the cancer morbidity and mortality will increase. Especially, treatment of lung cancer is more difficult than other cancers. Therefore, effective remedy is required strongly. In this study, daphnane diterpenes, yuanhualine (YL), yuanhuahine (YH), and yuanhuagine (YG) isolated from the flower of Daphne genkwa (Thymelaeaceae) exhibited potent anti-proliferative effects against A549 cells with the IC_(50) value of 7.0, 15.2, and 24.7 nM. Flow cytometric analysis revealed daphnane diterpenes induced cell cycle arrest at G0/G1 as well as G2/M phase in A549 cells. The cell cycle arrests were well correlated with the expression of checkpoint proteins including the up-regulation of cyclin-dependent kinase inhibitor p21 and p53, and down-regulation of cyclin A, cyclin B1, cyclin E, cyclin dependent kinase 2 and 4, cdc2, phosphorylation of Rb and cMyc expression. In addition, daphnane diterpenes inhibited the expression of Akt, Stat3 and src, which transmits integrin-dependent signals central to cell movement and proliferation, and induced the up-regulation of PTEN, which acts as a tumor suppressor gene. It indicated that the cancer cell growth inhibition by daphnane diterpenes might be in part mediated by the suppression of some signaling pathway. Daphnane diterpenes have an anti-proliferative activity against not only A549 and H292 cells but also gemcitabine-resistant A549, gefitinib-resistant H292, and erlotinib-resistant H292 cells. Synergy effects were also observed when yuanhualine was combined with gefitinib, erlotinib, sunitinib, and gemcitabine. Taken together, these findings suggest that daphnane diterpenes might provide a novel lead candidate for therapeutic agent against human lung cancer.