Functional role of NADPH oxidase 4(Nox4) in TLR5 signaling

Abstract

Toll-like receptors (TLRs) play key roles in the innate immune response by recognizing patterns in diverse microbial molecules. Several lines of evidence suggest that reactive oxygen species by NADPH oxidase (Nox) also plays an important role in innate immunity. However, a link between TLR activation and Nox isozyme is poorly understood. In this study, we demonstrated that TLR5 binds with C-terminal region of Nox4 resulting in ROS generation in HAECs in response to flagellin. Moreover, TLR5-dependent ROS generation did not require MyD88 which is key role molecule in TLR. Nox4-mediated ROS generation induced JNK phosphorylation but not phosphorylation of ERK and p38. Moreover, flagellin enhances the expression of chemocytokines and adhesion molecules on the surface of HAECs in Nox4 dependent manner, resulting in induced migration of monocytic cells. Taken together, flagellin-dependent TLR5 activation requires Nox4 activation in which ROS are essential modulators for JNK activation and AP-1 dependent pro-inflammatory cytokine production.;생명체는 끊임없이 침임자들의 공격을 받고 있다. 이들 침입자들의 공격을 막아내는 반응을 면역이라 하며, 우리 몸에는 이 면역을 담당하는 기관과 조직과 세포들이 따로 마련되어 있다. 이 시스템을 면역계라 하는데 면역체계(免疫體系, immune system)는 감염을 막기 위해 유기체의 내부에서 병원체와 종양세포를 찾아내 제거하는 과정을 말한다. 면역체계는 바이러스와 기생충을 비롯한 다양한 종류의 병원체를 감지하여 이를 유기체의 정상 세포 및 조직으로부터 구분해낸다. 병원체는 진화를 통해 유기체 내부에 적응하며, 숙주를 감염시키기 위한 새로운 방법을 끊임없이 개발해내기 때문에 이들을 완벽하게 감지해내는 것은 어려운 일이다. Toll-like receptors (TLRs)는 선천적 면역반응 (innate immune response)에 있어서 중요한 역할을 하는 Type 1 막 단백질로, 지금까지 13가지 종류의 TLR 중 사람에게서 10가지, 쥐에게서 13가지의 종류가 발현하고 있다. TLR이 밝혀진 이래로 TLR에 결합하는 ligand를 찾는 노력이 계속되어왔으며, 지금까지 TLR10, TLR12, TLR13을 제외하고 각각 하나 이상의 ligand가 밝혀졌다. TLR1과 TLR2는 박테리아의 mycobacterial lipoprotein과 triacylated lipopeptide를 인지하며, TLR2는 효모의 세포 벽 구성요소인 zymosan, gram-positice bacteria의 peptidoglucan(PGN)과 lipoteichoic acid(LTA)를 인지한다. 그리고 TLR1이나 TLR6와 함께 작용하여 glycosylphosphatidyl inositol-linked protein을 인지하기도 한다. TLR3은 RNA virus의 증식 중에 생기는 double-stranded RNA와 sdRNA의 analogue인 polyinosinic-polycytidylic acid(polyI:C)를 인지하는 것으로 알려져 있다. TLR4는 gran-negatice bacteria의 세포 막에 발현되는 lipopolysaccharide(LPS)의 수용체로 작용하며 TLR5는 Listeria monocytogen의 flagellin protein에 결합한다. TLR7과 TLR8은 virus에 감염된 세포에서 발견되는 GU-rich single-stranded RNS(ssRNA)에 대한 수용체로서 작용하며, TLR9는 bacteria와 virus DNA의 unmethylated CpG sequence motif와 결합하여 염증성 정보를 전달한다. 마지막으로 쥐의 TLR11은 uropathogenic E.Coli나 Toxoplasma gondii의 profilin-like protein과 같은 uropathogenic bacteria에 대한 수용체로 밝혀졌다. 뿐만 아니라 TLR은 endogenous molecule의 수용체로도 작용할 수 있는데, 이러한 사실을 미루어 볼 때 TLR분자가 조직 손상 시 염증반응에도 관여하리라 짐작할 수 있다. 한편 활성산소종(Reactive oxygen species)은 다양한 외부자극에 의해 세포막에 위치하는 NAD(P)H oxidase라는 효소를 통해 생성되는 물질로 세포의 성장, 분화, 사멸 등의 조절에 있어서 중요한 이차신호전달 물질로 작용한다. 이러한 활성산소종의 생성 메커니즘은 Neutrophil, monocyte, macrophage와 같은 포식세포에 존재하는 NAD(P)H oxidase 2(Nox2, gp91phox) 의 연구를 통해 밝혀지게 되었다. 이 효소는 두 개의 막 단백질인 gp91phox와 p22phox와 세 개 이상의 세포질 단백질들(p67phox, p47phox, p40phox, Rac1 or 2)로 이루어져 있다. 외부자극이나 병원균의 침입에 의해 세포질 내에 존재하는 단백질들이 인산화효소에 의해 인산화되고 그것은 단백질들 사이의 결합을 유도한다. 그 결과 효소적 활성을 가지는 NAD(P)H Oxidase Complex가 형성되고, 이 complex를 통해 전자의 이동이 일어나 활성산소종이 생성된다. 이렇게 생성된 활성산소종은 포식세포의 면역과정에서 침입한 병원균을 포식세포 내로 함몰하여 죽이는 과정에서 중요한 역할을 하게 된다. NAD(P)H Oxidase Complex를 이루는 구성단백질에 유전적인 돌연변이가 발생했을 때 침입한 병원균을 효과적으로 제거할 수 없게 되고 이는 Chronic Granulomatous Disease (CGD)와 같은 병변상황을 유도한다는 사실은 활성산소종의 중요성을 뒷받침해준다. Nox2의 발견이래로 NAD(P)H oxidase에 대한 활발한 연구가 진행된 결과 포식세포뿐만 아니라 비포식세포에서도 Nox2의 다양한 유사체(Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2)가 존재함이 보고되었다. 이 유사체들은 구조상의 유사성에도 불구하고 발현되는 조직이나 효소 활성에 요구되는 보조인자의 종류, 생성하는 활성산소종의 양, 그리고 관련되는 생리학적인 기능 등에서 큰 차이를 보인다. Nox1은 colon조직 및 colon관련 암 세포에, Nox3의 경우는 kidney, liver, lung 등의 fetal tissue에 많이 발현되어 있다고 알려져 있다. 또한 Nox4는 kidney, smooth muscle cells, endothelial cells 등에 과발현되어 있어 있으며, Nox5는 lymphoid organs과 testis에 존재한다. TLR과 Nox 사이의 상호 작용에 관하여서는 이미 여러 차례 보고된 바가 있으며, 병원균을 인식함에 있어서 TLR의 활성화와 Nox 사이의 연관성이 중요한 작용을 할 것으로 여겨지고 있다. LPS나 박테리아를 감염시켰을 때 Nox 단백질의 발현이 유도되고 활성화된다는 보고가 있으며, 활성산소종은 산화환원을 통해 조절되는 전사 조절인자인 NF-κB나 AP-1을 활성화시켜서 염증 자극에 의한 여러가지 사이토카인(Cytockines)을 분비한다. 따라서 Nox에 의하여 생성된 활성산소종이 TLR의 세포 신호 전달에 있어서 결정적인 역할을 할 것으로 생각할 수 있다. 그러나 TLR의 하위 역할을 하는 Nox의 구조적 아형(isoform)은 아직 적은 수 만이 밝혀져 있다. 따라서 TLR의 여러 종류 중 박테리아의 편모 단백질을 인식하는 TLR5의 하위 신호 전달체계를 이해하고 그 사이에서 활성산소종의 역할을 밝히기 위해 우리는 먼저 TLR5와 Nox의 여러 구조적 아형들 사이의 결합이 이루어지는가를 Yeast two hybrid system과 GST pull-down assay, Co-immunoprecipitation을 이용하여 알아보았다. 그 결과 Nox의 여러 구조적 아형들 중 Nox1과 Nox4만이 TLR5와 결합함을 보았다. 또한 TLR5의 외부 자극인 섬모 단백질(flagellin)을 처리하였을 때 결합의 세기에 큰 변화가 없었는데, 이를 통하여 외부 자극에 독립적으로 TLR5와 Nox1, Nox4가 서로 결합함을 알 수 있었다. 다음으로, TLR5와 Nox 사이의 결합이 실제로 활성산소종을 생성하는 데에 영향을 주는지를 알아보기 위하여 쥐의 평활근세포를 이용하여 활성산소종의 생성을 측정하였다. 그 결과 정상 쥐의 평활근세포에 flagellin을 처리하였을 때 활성산소종이 생성되었고, Nox1이 결함된 쥐의 평활근세포에서도 역시 flagellin에 의하여 활성산소종이 생성되는 것을 확인하였다. 평활근세포에서는 Nox1과 Nox4가 주로 발현되어 있으므로, Nox1이 결함된 쥐의 평활근세포에서 생성된 활성산소종은 Nox4에 의하여 생성된 것임을 알 수 있었다. 이를 다시 확인하기 위하여 사람의 대동맥 내피세포에서 siRNA를 사용하여 Nox4의 발현을 감소시켰는데, Nox4가 정상적으로 발현하는 대동맥 내피세포에서는 flagellin에 의하여 활성산소종이 생성되었으나, Nox4의 발현을 감소시킨 경우 활성산소종이 거의 생성되지 않았다. 그리고 생성된 활성산소종이 세포 내에서 어떠한 역할을 하는지를 알아보기 위하여 Mitogen-activated protein kinases (MAPK)의 활성 정도를 관찰하였다. Flagellin에 의하여 ERK, JNK, p38MAPK가 모두 활성화 되었지만, Nox4의 발현을 감소시켰을 때에는 JNK의 인산화만이 감소하였는데, 이를 통해 TLR5/Nox4의 신호 전달 시스템의 하위에 JNK가 관여한다는 사실을 알 수 있었고, 카탈라아제를 과발현시켰을 때 JNK의 인산화가 감소함을 통하여 역시 Nox4에 의한 활성산소종이 JNK를 활성화시킨다는 것을 밝혔다. 또한 JNK의 억제물질인 SP600125를 처리하였을 때에는 flagellin에 의한 활성산소종 생성에 영향이 없는 것으로 보아 Nox4가 JNK의 상위에 위치한다는 것을 다시 한 번 확인하였다. 다음으로, 활성화된 JNK는 AP-1 전사인자를 활성화시키고 여러 가지 염증 관련 사이토카인의 분비를 증가시켰다. 그런데 Nox4의 발현을 감소시켰을 때에는 AP-1의 전사인자의 활성이 감소되고, 사이토카인의 분비 역시 감소함을 알 수 있었다. 마지막으로 flagellin에 의한 Nox4의 활성산소종 생성이 단핵구 세포의 이동에 영향을 주는지 알아보았다. 혈관내피세포의 Nox4 발현을 감소시켰을 때에는 flagelin이 있어도 단핵구 세포의 이동이 정상세포보다 현저히 감소하였다. 위의 결과를 통하여 TLR5 신호 전달 시스템에서 Nox4에 의한 활성산소종의 생성이 중요한 역할을 함을 알 수 있었고, 이는 세포 내에서의 활성산소종의 생성과 산화적 스트레스에 의한 병리학적인 반응을 연구하는 것이 세포 내 신호전달을 연구하는 데 있어서 중요한 역할을 할 것임을 시사한다.