Functional characterization of UCH-L1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1) as a target molecule in cancer invasion

Abstract

암세포의 전이와 이동을 저해하는 물질은 매우 효과적인 항암제로 사용 될 수 있다. 암세포의 전이에 관계하는 핵심 단백질을 찾기 위해 전이능력이 서로 다른 세 가지의 폐 조직 세포를 사용하여 각각의 세포에서 세포 안과 밖에서 서로 다르게 발현되는 단백질이 어떤 것이 있는지 단백질 분석법을 통하여 알아보았다. 그 결과 전이 능력이 높은 세포에서 Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1)이 매우 많이 발현되어있음을 알 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 우선UCH-L1이 암세포의 전이에 핵심적인 기능을 하는 단백질인지 확인하기 위해 UCH-L1을 과 발현시키거나 발현을 억제한 상태에서 암세포의 전이 능력과 세포모양의 변화를 살펴보았다. 그 결과 UCH-L1의 과 발현은 암세포의 전이를 증가시켰고 세포모양을 변화시킴을 알 수 있었다. 이 연구에서는 UCH-L1의 발현정도와 전이 능력의 상관성이 밀접한 관련성이 잘 나타나 있다. UCH-L1의 과 발현에 의해 세포는 사방으로 뻗는 모양을 보였다. UCH-L1이 어떻게 세포의 이동과 모양을 변화시키는지 알아보기 위해 UCH-L1과 상호작용하는 단백질에는 무엇이 있는가를 단백질 분석법을 통해 확인하였다. Peptide finger printing방법을 이용한 실험에서 b-actin, hsp70, 44kDa protein kinase (MAPK), hnRNP, cytoskeletal keratin 등 여러 단백질들이 UCH-L1과 상호작용함을 알 수 있었고 이 결과는 ESI-q-TOF tandom MS를 통해 재확인되었다. 또한 UCH-L1과 결합하는 단백질들은 western blot 분석과 confocal자료로 다시 확인되었다. UCH-L1이 세포 신호전달에 영향을 주는지 확인하기위해 UCH-L1이 과 발현된 상태에서 MAPK 신호를 관찰하였다. 그 결과UCH-L1 의 과 발현은 세포 내에서 Akt의 활성을 증가시키는 것이 확인되었다. 이 결과는 UCH-L1이 세포 내에서 생존과 관련된 신호와 관련되어있으며 UCH-L1에 의해 증가한 세포의 전이성 증가가 Akt의 활성화를 경유한다는 것을 시사한다. 다음으로 우리는 UCH-L1이 Matrix metalloprotease (MMP)에 영향을 주는지 알아보았다. 그 결과 UCH-L1과 MMP의 활성과는 연관성이 없음을 알아내었다. 이러한 결과는 UCH-L1이 Akt 신호를 조절하고 세포골격의 변화를 일으킴으로써 암세포 전이에 관여한다는 것을 의미한다.;The agent inhibiting tumor invasion and metastasis can be effective as a cytostatic anti-cancer drug. To find the key molecules involved in tumor invasion, differentially expressed proteins in various lung cancer cell lines having differential invasion potential were screened with proteomic analysis. Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) was highly overexpressed in invasive cell line. To determine whether UCH-L1 is a key modulator of tumor invasion, the invasion potential and morphological change of cell lines either overexpressed or knocked down UCH-L1 were examined. In this study, correlations between UCH-L1 expression level and invasion potensial were well illustrated. Overexpression of UCH-L1 induces the cell shape being well spreaded. To investigate how UCH-L1 overexpression regulates cell motility and cell shape, UCH-L1 interacting proteins were identified using proteomic analysis. Various proteins including b-actin, hsp70, 44 kDa protein kinase (MAPK), hnRNP and cytoskeletal keratin were identified as UCH-L1 interacting proteins using peptide finger printing by MALDI-TOF MS and sequencing by using ESI-q-TOF tandom MS. These were confirmed with western blot analysis and confocal datas. To determine whether UCH-L1 affects the signaling pathways, MAPK signaling in UCH-L1 overexpressing cells were examined. The overexpression UCH-L1 significantly up-regulates Akt activation. This data indicates that UCH-L1 is involved in survival signaling and Akt phosphorylation may mediate the increase of invasion in UCH-L1 overexpressed cells. Next we examined whether UCH-L1 affects the activity of Matrix metalloprotease (MMPs). No relationship between MMP activity and UCH-L1 overexpress was identified. These results suggest that UCH-L1 is involved in cancer invasion by modulating the signaling pathway in Akt signaling and inducing the cytoskeletal changes.