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Development and Application of Antibodies Specific for PLC-γ1 phosphorylated at Y783

Development and Application of Antibodies Specific for PLC-γ1 phosphorylated at Y783
Issue Date
대학원 생명·약학부
이화여자대학교 대학원
Phospholipase C-γ1 (PLC-γ1) contains a unique long insert sequence between catalytic X and Y domain consisted of splited Pleckstrin homology (PH), two Src homology 2 (SH2), and an SH3 domains. In a previous study, the autoinhibitory function of this insert sequence has been demonstrated. After PLC-γ1 is stimulated, phosphorylated Y783 residue (pY783) associates with the COOH-terminal SH2 domain [SH2(C)] within the same molecule of PLC-γ1. The phosphorylation of Y783 works as a molecular switch that reverses the autoinhibition. However, the function of intramolecular interaction has not been confirmed yet in a live cell, in vivo. Here in this report, it was found that the conditional blocking of pY783 inhibits the downstream signaling of active PLC-γ1 and Ca2+ influx. For a conditional blocker of pY783, an antibody was developed by phage display method. The selected antibody recognizes phosphorylated Y783 residue on denatured and native PLC-γ1. Using this modification-specific antibody, I confirmed that blocking of pY783 residue of PLC-γ1 by an intrabody significantly decreased intracellular free Ca2+ concentration, even after PDGF-BB treatment. Understanding the molecular function of site-specific inhibition in a live cell might enable us to develop more selective signaling inhibition method.;인지질분해효소 C-γ1 (Phospholipase C- γ1, PLC-γ1)는 분리된 Pleckstrin homology (PH), 2개의 Src homology 2 (SH2), SH3 영역들로 이루어진 길고 삽입된 구조가 촉매작용을 하는 X와 Y 영역 사이에 있다. 이전의 연구에서, 이 구조의 자가억제 (autoinhibition)의 기능이 밝혀졌다. PLC-γ1이 자극을 받은 후 인산화된 Y783 (pY783)잔기는 카르복실산 말단 (COOH-terminal)의 SH2 영역과 결합한다. Y783의 인산화는 자가억제를 바꾸는 분자적 스위치 (molecular switch)로 작용한다. 그러나 분자 내 결합 (intramolecular interaction)은 아직까지 살아있는 세포에서 그 기능이 증명되지 않았다. 이 논문에서, pY783의 조건적인 차단이 활성화된 PLC-γ1의 하위 신호인 칼슘이온의 유입을 억제한다는 것이 밝혀졌다. pY783의 조건적인 방해물로써, phage display 방법을 이용하여 항체를 개발하였다. 선택된 항체는 변성되고 본래의 PLC-γ1의 pY783 잔기만 선택적으로 인식하였다. 이러한 특정 위치에 선택적인 항체를 이용하여, PLC-γ1의 pY783이 차단된 세포는 PDGF-BB 자극이 있는 후에도 세포내의 자유 칼슘 이온 농도가 정상세포에 비해 매우 낮았다. 살아있는 세포에서 특정 위치 선택적인 억제의 분자적인 기능을 이해한다는 것은 더 선택적인 신호 억제를 개발하는 잠재적인 도구가 될 수 있을 것이다.
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