Functional role of Toll-like receptor 2 (TLR2) - NADPH oxidase 1 (Nox1) complex in vascular remodeling

Abstract

인체는 외부에서 오는 많은 병원균에 대항하기 위한 정교한 면역체계를 가지고 있다. 이것은 선천성 면역체계로 포식세포, 수지상세포, 중성구와 내피세포 같은 면역에 관련된 세포의 표면에 발현되어 있는 수용체를 통해 세균이나 미생물들이 만들어내는 물질들을 인식하여 염증반응을 일으킨다. 선천성 면역체계로 잘 알려진 TLR (Toll-like receptor)은 type I 막 단백질로 세포외부로 존재하여 PAMP (pathogen-associated molecular patterns)을 인식하는 N-말단 leucine rich repeat (LRR)영역과 세포질에 노출되어 세포의 내부에 존재하는 여러 단백질들과 상호작용할 수 있는 C-말단에 위치한 TIR (Toll/IL-1R homology domain)영역으로 구성되어 있다. 1980년도에 초파리 (Drosophila melanogaster)의 배아 발생연구 중에 발견되어 오늘날까지 포유동물에서 13가지 종류의 TLR이 밝혀졌다. 사람에서 11종류, 쥐에서 13종류가 발견되었다. TLR종류에 따라 인식하는 배위자가 각기 다르다고 알려져 있는데 TLR3는 이중가닥 바이러스의 RNA를 인식하고 가장 연구가 많이 되어 있는 TLR4는 CD14와 MD-2와 결합하여 그람 음성균의 리포다당질과 MM-LDL을 인식하며 TLR5는 세균의 편모단백질을, TLR7과 TLR8은 외가닥으로 이루어진 바이러스 RNA를, TLR9은 CpG DNA를 인지한다. TLR들 중에 TLR2는 TLR1과 TLR6와 이질이합체를 이루어 넓은 범위의 배위자를 인식하는 것으로 알려져 있다. TLR2의 배위자 중 Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) 는 세균의 지질단백의 아실화된 아미노 말단을 모방한 합성된 tripalmitoylated lipopeptide로서 TLR2에 의해 인지되고 TLR2와TLR1과 결합을 유도하여 NF-κB 같은 염증반응에 관련된 전사인자를 활성화시켜 MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), IL-8 (interleukin-8) 과 같은 cytokine의 생성 및 염증세포들이 결합할 수 있도록 도와주는 adhesion molecule인 ICAM-1 (intracellular adhesion molecule-1)을 발현시킨다. 최근 보고에 따르면 혈관 내 일어나는 염증반응의 하나인 죽상경화판에서 TLR1, TLR2, TLR4의 발현이 증가되어 있고, 혈관벽을 이루는 평활근세포 (smooth muscle cell) 에서도 TLR이 발현되어 있다. 그 중, 두개강내동맥폐쇄성 질환 (arterial occlusive disease)에서 TLR의 역할을 밝히는 연구로TLR4에 초점을 두어 그 동안 연구가 많이 되어 왔다. 최근 들어 혈관의 외진섬유모세포 (adventitial fibroblast)에서 TLR2를 활성화시키는 자극이 왔을 때 IL-1alpha, IL-1beta, IL-1Ra, IL-6, IL-8, MCP-1과 같은 cytokine, chemokine을 생성하여 염증반응을 유도하여 동맥경화를 일으킨다는 보고가 있지만 TLR2를 통해 직접 혈관에 미치는 자세한 조절기전은 아직 분명하게 밝혀진 바가 없다. 혈관질환인 동맥경화는 다양한 요인에 의해 혈관벽에 손상이 생겼을 때 궁극적으로는 상처를 치유하기 위해 혈관내피세포 안쪽에 위치한 평활근 세포가 이동 (migration)하여 상처부위에 자리잡아 증식을 하여 결과적으로 혈관벽이 좁아지는 질환이다. 혈관 평활근 세포의 증식의 원인으로 활성산소종 (Reactive oxygen species; ROS)이 관여한다는 연구도 있다. 이 활성산소종은 세포 내 많을 경우 독성으로 작용하지만, 생리적 농도에서는 세포의 증식과 분화, 사멸 등의 조절에 있어서 중요한 이차신호전달 물질로 작용한다. 이러한 활성산소종의 생성 기작은 포식세포의 세포막에 존재하는 NADPH oxidase 2 (Nox2, gp91^(phox))의 연구를 통해 밝혀지게 되었다. 이 효소는 두 개의 막 단백질인 gp91phox 와 p22^(phox) (cytochrome b_(558))와 세 개 이상의 세포질 단백질들 (p67^(phox), p47^(phox), p40^(phox), Rac1 or 2)로 이루어져있다. 외부자극이나 병원균의 침입에 의해 세포질 내에 존재하는 단백질들이 인산화 효소에 의해 인산화되고 그것은 단백질들 사이의 결합을 유도하여 활성산소종을 생성한다. 뿐만 아니라 비포식세포에서도 Nox2의 다양한 유사체 (Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2)와 세포질 단백질의 유사체 (Noxo1; p47^(phox) 유사체, Noxa1; p67^(phox) 유사체)도 존재함이 보고되었다. 발현의 정도는 조직마다 다르며 Nox1의 경우 결장상피세포 (colon epithelial cell)에서 많이 발현되어있으며, Nox3는 신장, 간, 폐 등의 fetal tissue에서 발현되어있으며, Nox4는 신장조직에서 많이 발현되어있다. 혈관에서 Nox4는 혈관벽 모든 층에 전체적으로 발현되어있으며 Nox2는 내피세포와 외진피 세포에서 발견되고, Nox1은 평활근세포와 내피세포에서 발현된다고 알려져 있다. 이러한 점을 고려해 볼 때 혈관 내에서 일어나는 세포의 이동(migration)을 유도하는 많은 인자들은 산화환원 (redox-sensitive)에 민감할 것이라고 생각된다. 위에서 언급했듯이 TLR을 통해서 혈관 내 일어나는 염증반응과 활성산소종과의 조절기전을 밝히기 위해 우리는 먼저 yeast two-hybrid system과 GST pull-down assay, Immunoprecipitation을 이용하여 TLR2 와 활성산소종을 생성해내는 Nox 유사체들 간의 결합을 보았다. 이중 Nox1이 TLR2와 강하게 결합하는 것을 보았고 이 결합이 TLR2의 agonist인 Pam3CSK4에 의해서는 더 약하거나 강하게 결합되지 않았다. 이것으로 보아 외부자극에 독립적으로 두 단백질이 계속적으로 상호작용을 하고 있음을 알 수 있었다. 다음으로 Pam3CSK4자극이 TLR2에 의해 인지 되는데 실제로 TLR2와Nox1과의 상호작용으로 활성산소종을 생성하는지 알아보기 위해 동물모델을 사용하였다. Nox1과 Nox2을 발현하고 있으며 cytokine을 생성하여 동맥경화를 유도하는 것으로 알려져 있는 복강 포식세포 (peritoneal macrophage)와 평활근세포에서 Nox1의 기능을 분석하기 위하여 정상 쥐, Nox1-/-쥐, Nox2-/-쥐로부터 복강 포식세포와 평활근세포를 얻어 Pam3CSK4에 의한 활성산소종을 측정하였다. 정상 쥐에서 분리한 세포에서는Pam3CSK4에 잘 반응하여 활성산소종을 생성하는 반면 Nox1-/-쥐에서 분리한 세포에서는Pam3CSK4자극에 의한 활성산소종 생성이 이루어지지 않았다. 이것으로 포식세포와 평활근세포에서 Pam3CSK4에 의한 활성산소종 생성에 Nox1이 관여함을 밝혔다. 우리는 또한 Pam3CSK4에 의한 세포의 이동에 Nox1이 관여하는지 알아보았는데 Pam3CSK4자극이 있어도 Nox1-/-에서는 세포의 이동이 정상에 비해 현저히 감소되어있음을 보았고 동물 모델에서도 정상 쥐에 비해Nox1이 발현되지 않을 때 신생혈관내막 (neointima)이 증가되지 않음을 보았다. 위의 실험을 통해서 우리는 혈관에서Nox1에 의한 활성산소종의 생성이 염증반응에 있어서 중요한 기능을 함을 밝혀내었다.;Pam3CSK4 is a synthetic tripalmitoylated lipopeptide that mimicks the acylated amino terminus of bacterial lipoproteins. Recognition of Pam3CSK4 by Toll-like receptor 2 (TLR2) induces the activation of NF-κB which in turn stimulates the production of proinflammatory cytokines. Although recent evidences suggest a role of TLR signaling in the development of atherosclerotic lesions, the molecular connection between TLR2 and the pathogenesis of atherosclerosis is unclear. In this study, we showed that TLR2 signaling promotes a change of proinflammatory phenotype in mouse arterial smooth muscle cells (ASMCs), characterized by increased reactive oxygen species (ROS) production and SMC migration. We identified interaction between TLR2 and NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxidase 1 proteins using yeast two hybrid, GST pull down, and co-immunoprecipitation. Mouse peritoneal resident macrophages and ASMCs from Nox1-/- mice showed to fail the generation of ROS in response to Pam3CSK4. We also found that Pam3CSK4 stimulated migration of ASMCs from wild type in Transwell system, but not in ASMCs from Nox1-/- mice. Moreover, neointima formation in Nox1-/- mice was significantly reduced compared to that in wild type, indicating that Nox1 is key player in vascular remodeling. Take together, these data suggest that Nox1 plays an important role in TLR2-mediated ROS generation which in turn to stimulate SMC migration and vascular remodeling.