Cell death induced by over-expression of Thoc5

Abstract

Thoc5 (formerly called FMIP) is a member of THO and TREX complex that plays a role in coupling transcription to mRNA export. Thoc5 takes part in M-CSF signaling and in messenchymal cell differentiation. Recently, Thoc5 is known to be a common target leukaemogenic oncogenes, but a cellular function of Thoc5 is still unclear. To Investigate cellular function of Thoc5, we generated EGFP tagged Thoc5 expression vector (pEGFPThoc5). EGFPThoc5 showed punctate expression in the nucleus, generally 5-20 of circular bodies, each 1~1.5 μm in diameter. Immunostaining revealed that EGFPThoc5 was not colocalized to none of nucleolus, speckle and PML bodies. Interestingly, nucleolar structure was a partially broken in EGFPThoc5 expressed cells, and confocal analysis showed that EGFPThoc5 was closely associated with PML bodies. Truncated EGFPThoc5 mutants exhibited the loss of punctate expression except 'exon' deletion mutant and Thoc5 seems to have at least two NLSs in N-terminal and C-terminal domain. Moreover, over-expression of EGFPThoc5 resulted in cell shrink and finally cell death. This study suggests that Thoc5 may involve in the maintenance of nuclear structure and over-expression of Thoc5 may result in cell death by perturbation of nuclear bodies such as nucleolus and PML bodies.;FMIP (Fms interacting protein)로 알려져 있는 Thoc5는 세포 내에서 비활성인 c-Fms receptor에 결합하고 있는데, ligand인 Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) 가 결합하게 되면 receptor는 활성화가 된다. Receptor는 dimer를 형성하는데 이때 비활성인 receptor에 결합하고 있던 Thoc5는 분리되는 것으로 알려져 있다. M-CSF와 FMIP는 인산화된 PKC에 의해 세포 내 localization을 조절하고, 그것에 의하여 M-CSF를 매개로 한 것과, 또한 C/EBPalpha의 downmodulation에 세포의 분화를 가능하게 한다는 의해 C2C12 cell에서 지방세포 lineage commitment를 FMIP가 조절한다는 보고가 있었다. 최근에 Thoc5는 inositol lipid의 turnover에 영향을 주는 leukaemogenic tyrosine kinase의 target이 되는 spliceosome 단백질로서 leukaemogenesis에 잠재적인 역할을 하여 신호전달을 조절하는 새로운 target으로 보고된 바 있다. TREX complex에 속하는 THO complex의 한 member로서 fSAP79로도 알려진 Thoc5는 이들과 함께 mRNA export에 관여하고 있으나, 아직 Thoc5의 세포 내 역할에 대해서는 명확하게 알려진 바가 없다. Thoc5의 세포 내에서의 기능을 알아보기 위해 우리는 먼저 Thoc5 의 cDNA에 EGFP의 달아 expression vector를 구축하였고, 이것을 세포 내에서 발현 시켜보았다. HeLa, NIH3T3 세포 주 등에서 임시적으로 발현 시켰을 때 핵 내에서 최소 5개에서 최대 20여 개이고 직경이 1~1.5 μm 정도인 작은 반점형태 (punctate)를 형광현미경을 통하여 확인할 수 있었다. 따라서 핵 내의 어떤 small nuclear bodies와 colocalization을 이루는지 immunocytochemistry 방법으로 nucleolus, speckle과 PML을 선정하여 실험하였다. 실험의 결과, 이 세 가지 후보자들 모두 Thoc5와 colocalization을 이루지는 못하였으나, EGFPThoc5가 발현된 세포에서는 nucleolus가 정상세포에 비해 깨져있는 것이 확인 되었다. 또한 confocal 분석을 통하여 Thoc5는 PML과 근접하게 위치한다는 것을 알 수 있었다. 작은 반점형태로의 발현이 되는 원인을 알기 위해서 Thoc5 의 NH_(2-) 말단과 COOH-말단을 절단하여, 세포 내에서 발현을 시켜보았다. 완전한 Thoc5를 제외한 나머지 절단된 형태에서는 작은 반점형태의 발현 양상은 보이지 않았으나, 모두 핵 내에 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이로써, Thoc5는 NLS가 NH2 -말단과 COOH-말단 양끝에 최소한 2개는 존재할 것으로 예상되며, 작은 반점형태의 발현양상은 절단된 형태에서는 보이지 않았다. 작은 반점 형태의 발현은 Thoc5의 완전한 형태가 요구되며, 또한 exon3를 제외한 모든 부분이 이 구조를 이루는데 필수적이라고 사료된다. 마지막으로 Thoc5를 발현하는 세포 주를 구축하고자 하였으나, 이것을 Thoc5의 과 발현이 되면 세포가 죽음에 이르는 것이 관찰되었다. 확인하고자 일시적으로 세포 내에서 Thoc5의 발현을 시켜 시간 별로 관찰한 결과 발현된 세포는 점점 오그라들면서 결국은 죽음에 이르렀지만, Thoc5가 발현이 안 된 세포는 정상적으로 세포분열을 하는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 Thoc5가 낮은 상태로 발현이 될 경우에는 죽음에 이르지 않고, parent vector인 EGFP-C2만 발현이 될 경우에도 정상적으로 세포분열이 이루어 지는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 이러한 현상을 이해하고자 inducible하게 Thoc5의 발현을 조절하는 세포주를 구축하여 실험한 결과, 임시로 발현시켰을 때와는 다르게 죽음에 이르지 않는 것을 확인하였다. 이러한 현상을 이해할 수 있는 메커니즘이 아직 밝혀지지 않아 이 부분에 대한 더 많은 연구가 필요하다.