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High-throughput Screening Assay of α_(1G) T-type Ca^(2+) Channels and Comparison with Patch-clamp Studies

Title
High-throughput Screening Assay of α_(1G) T-type Ca^(2+) Channels and Comparison with Patch-clamp Studies
Other Titles
알파1G T-type 칼슘채널의 HTS 분석법과 패치클램프 스크리닝의 비교연구
Authors
김윤지
Issue Date
2008
Department/Major
대학원 생명·약학부
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
Although whole-cell patch-clamp techniques are powerful tools for studying biophysical and pharmacological properties of ion channels, recent validation of ion channels as novel drug targets requires the development of rapid, reliable, and sensitive cell-based high-throughput screening (HTS) methods for ion channels. In the previous study (Kim et al., 2004), had been made HEK293/α1G/Kir2.1 cell lines which stably expressed α1G and Kir2.1 subunits and it was reported that α1G channel-sensitive Ca^(2+) signals were detected by application of high concentration of KCl under fura-2-based single cell measurements of intracellular Ca^(2+) concentration ([Ca^(2+)]i). In the present study, it is applied HEK293/α1G/Kir2.1 cells into the FDSS6000 (Functional Drug Screening System) system to develop a fast and reliable cell-based HTS method for α1G channels. After detecting 70 mM KCl-induced [Ca^(2+)]i increases using the FDSS6000 system, I verified this new α1G channel HTS system by examining T-type Ca^(2+) channel blockers, Ni^(2+) and mibefradil, and measuring the Z´-factor (Z´ factor = 0.66) in 96-well plates. Furthermore, the 10 selected 3,4-dihydroquinazoline derivatives were assayed using this FDSS6000-based α1G channel HTS system at the level of IC_(50) values and compared the results with the ones obtained from standard whole-cell patch-clamp recordings. For 3,4-dihydroquinazoline derivatives, the IC_(50) value using FDSS6000 assay and whole-cell patch-clamp recording were similar. Taken together, these results suggest that the FDSS6000-based α1G channel HTS system is a fast and feasible assay method for α1G T-type Ca^(2+) channels and can be utilized to screen chemicals as a primary screening method and to develop HTS systems for other types of ion channels.;전 세포 패치 클램프 기술이 이온채널의 생리학적 약리학적 특성을 연구하는데 가장 적합한 방법이 되고 있긴 하나, 최근 자료에 의하면 새로운 약물 타겟 에서 이온채널은 빠르고, 믿을만하고, 민감한 스크리닝 방법의 개발이 필요 하다. 본 연구실의 이전 연구에 따르면 α1G 와 Kir2.1의 서브유닛을 발현시켜 만든 HEK293/1G/Kir2.1 세포주를 사용하여 단일 세포의 세포 내 칼슘농도 측정을 하였는데, fura-2 (or fluo-3) based높은 농도의 KCl을 적용함으로써 1G 채널에 민감한 칼슘 신호가 확인 되었다. 그러므로 본 석사 논문에서는 α1G 채널 억제제 개발을 위해 빠르고 믿을 수 있는 cell-based HTS 방법을 개발해 FDSS6000 (기능적인 약물 스크리닝 시스템) 에 HEK293/α1G/Kir2.1 세포주를 적용시켰다. 다음으로 FDSS6000 시스템을 사용해 70mM KCl 에 의해 유도된 칼슘레벨의 증가를 확인하였으며, 니켈이나 mibefradil 같은 T-type 칼슘채널 차단제의 실험과, 96-well plate에서 Z’-factor (Z’ factor = 0.66)의 측정에 의해 새로운 1G 채널 HTS 시스템을 증명했다. 게다가 IC_(50) 값의 레벨에서 FDSS6000-based α1G 채널 HTS 시스템을 사용해 3,4-dihydroquinazoline 계열의 선별된 10가지 약물을 분석했고, 표준 전 세포 패치 클램프에서 얻어진 결과와 비교하였다. 두 가지 실험 패치 클램프 실험과 HTS 실험 각각의 IC_(50) 값이 비슷하게 나왔으므로 HTS 시스템에 확신을 가지게 되었고, 패치 클램프 실험으로 본 약물 스크리닝은 농도의존적인 결과를 보여주었다. 결과적으로 FDSS6000-based 1G 채널 HTS 시스템은 α1G T-type 칼슘채널에서 빠르고 적합한 분석 방법이고, 화학약품의 초기 스크리닝에 이용되며, 다른 종류의 이온 채널에서 HTS 시스템 개발을 가능하게 할 것이다.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
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