A₃adenosine 수용체에 선택적인 아데노신 유도체의 항염증 효과와 항암 활성 및 그 작용기전에 관한 연구

Abstract

Adenosine, a purine nucleoside, is released from metabolically active cells into extracellular space and plays important roles in various pathophysiological processes. Adenosine regulates many biological responses including inflammation and cancer cell growth by the interaction with their receptors such as A1, A2A, A2B and A₃. Especially, A₃ adenosine receptor (A₃AR) is considered to be expressed in macrophage cells and cancer cells. To the end, human A₃AR agonists have been reported to have an anti-inflammatory and anti-cancer activity. Also, as adenosine analogs, A₃AR selective antagonists have an anti-inflammatory activity. In our continuous efforts to develop new anti-inflammatory agents, we found novel adenosine analogs, 2-chloro-N^(6)-(3-iodobenzyl)-4’-thioadenosine-5’-N-methyluronamide (thio-Cl-IB-MECA) for a potent human A₃AR agonist and LJ-1888 for a potent human A₃AR antagonist. On this line, this study was designed to investigate whether thio-Cl-IB-MECA and LJ-1888 have an anti-inflammatory potential in in vitro and in vivo model. Thio-Cl-IB-MECA and LJ-1888 exhibited an effective anti-inflammatory activity. The expression of pro-inflammatory biomarkers including inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukine-1β (IL-1β), tumor necrosis factor (TNF-α), and cyclooxygenase-2 (COX-2) were suppressed by the treatment of adenosine analogs in the protein and mRNA levels in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 cells. Furthermore, these adenosine analogs suppressed NF-κB activation via inhibition of IκB degradation and blocked nuclear translocation of NF-κB p65 subunit. In addition, in in vivo LPS-induced mouse endotoxemia model, thio-Cl-IB-MECA revealed the increase of survival rate compared to vehicle-treated mouse. The analysis of the protein levels of iNOS, IL-1β, and TNF-α was also suppressed in the compound-treated group. In carrageenan-induced mouse paw edema model and TPA-induced ear edema model, LJ-1888 also prevented inflammatory edema. These results suggest that adenosine analogs, thio-Cl-IB-MECA and LJ-1888, might have an anti-inflammatory activity through the inhibition of pro-inflammatory cytokine expressions via suppression of NF-κB signaling pathway. Therefore, they might be potential candidates in the development of novel anti-inflammation drugs. Human A₃ adenosine receptor (A₃AR) agonists have been shown to play important roles in growth inhibition of various human cancer cells. On this line, we investigated whether thio-Cl-IB-MECA have an anti-cancer potential in human prostate cancer cell LNCaP and PC-3 cells. As a result, thio-Cl-IB-MECA inhibited the growth of LNCaP and PC-3 human prostate cancer cells by arresting cell cycle. Thio-Cl-IB-MECA suppressed cell proliferation with the accumulation of cells in G0/G1 phase arrest and regulated the expression of proteins known to be related with G0/G1 phase arrest and Wnt signaling pathway. In addition, especially in PC-3 cells, thio-Cl-IB-MECA down regulated A₃AR mRNA and protein expressions, indicating that inhibitory effects of prostate cancer cell proliferation and Wnt signaling pathway via A₃AR receptor down regulation. These findings suggest that a novel A₃AR agonist, thio-Cl-IB-MECA might be a lead candidate for further development of anticancer agents.;아데노신 (adenosine) 은 세포 내에서 ATP 분해에 의해 생성되는 것으로 세포내의 아데노신이 축적이 되면 세포 외로 방출되는데 염증 관련 질환, 허혈성 심 질환 및 조직 손상과 같은 병태 생리학적 과정이 있을 경우 세포 내에서 ATP의 대사는 더 활발해 지고 그 결과 아데노신의 방출이 증가한다고 알려져 있다. 아데노신은 아데노신 수용체를 경유하여 신호 전달을 하게 되는데 아데노신 수용체에는 4종류, A1, A2A, A2B and A₃ 가 존재하고 있다. 특히, A₃ adenosine receptor (A₃AR)는 효능제는 항암 및 항염증 활성이 있으며 길항제 역시 항염증 활성을 지닌다고 알려져 있다. 아데노신 유도체로 A₃AR에 선택적인 효능제인 2-chloro-N6-(3-iodobenzyl)-4’-thioadenosine-5’-N-methyluronamide (thio-Cl-IB-MECA) 와 선택적인 길항제인 LJ-1888를 이용하여 마우스 유래 대식 세포인 RAW 264.7 세포에서의 항염증 활성을 알아보고 염증성 동물 모델에서 효과를 알아보았다. 먼저 lipopolysaccharide (LPS)로 염증 반응을 유도한 RAW 264.7 세포에 아데노신 유도체를 처리하고 NO 생성 저해 활성을 평가한 결과 thio-Cl-IB-MECA의 IC50 값은 16.23 μM, LJ-1888의 IC50 값은 10.16 μM 이었다. 따라서 아데노신 유도체의 항염증 활성에 관한 작용 기전을 추가적으로 연구한 결과 염증성 물질인 inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukine-1β (IL-1β), tumor necrosis factor (TNF-α) 와 cyclooxygenase-2 (COX-2) 의 mRNA 및 단백질 발현이 모두 저해되었다. 또한 염증성 물질의 유전자 발현에 영향을 미치는 LPS에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 알아본 결과, 전사 인자인 NF-κB의 subunit인 p65의 결합을 방해하여 핵 내에서 NF-κB의 DNA 결합도 저해하였고, NF-κB의 핵 내 이동을 저해하는 IκB분해도 저해하였다. Thio-Cl-IB-MECA의 경우는 또 다른 신호 전달 경로인 PI-3 kinase/β-catenin의 경로에서도 세포 증식과 COX-2발현에 영향을 끼치는 GSK-3β 및 β-catenin의 핵 내로의 이동을 저해하는 것으로 알 수 있었다. 면역 약화를 통한 LPS로 유도한 패혈증 동물 모델의 경우에서도, thio-Cl-IB-MECA를 처리한 군에서 생존율이 높아졌으며 IB-MECA 보다 효과가 우수하였다. 추가적으로 동물 조직에서의 염증성 물질의 단백질 발현을 확인한 결과, iNOS, IL-1β, TNF-α의 발현이 억제되어 있었다. 또한, 세포 수준에서의 활성 평가를 토대로 LJ-1888의 항염증 활성을 알아보기 위해 carrageenan으로 paw edema를 유발하고 TPA로 ear edema를 유발한 뒤 항염증 활성을 알아본 결과, 두 동물 모델에서 LJ-1888의 효능은 indomethacin에 비해 동일 농도에서 효과가 우수하였으며 농도 의존적인 염증성 부종의 저해 효능을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다. 선택적인 A₃AR은 암 세포 증식 억제에 효과가 있다고 알려져 있으므로, thio-Cl-IB-MECA의 사람 전립선 암 세포인 LNCaP (AR+) cells 와 PC-3 cells (AR-) 에 대한 영향을 주는지 알아보았다. Thio-Cl-IB-MECA를 농도별로 처리한 결과 72 시간에서의 IC50값은 각각 18.56 μM (LNCaP cells), 20.36 μM (PC-3 cells)로 암 세포의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 암 세포 증식 억제 효과는 G1 phase arrest를 유발시키는 종양 억제 인자인 p53의 증가와 cyclin/CDK 복합체를 억제하는 p27의 발현 증가와 더불어 cyclin D1, cyclin A, CDK4, c-myc 등 세포 주기를 조절하는 인자들의 발현을 억제하여 암 세포의 증식을 억제하는 것으로 생각된다. 또한 PC-3 cells 에서는 이러한 세포 증식의 효과가 Wnt 신호 전달 경로를 경유할 뿐 아니라 A₃AR의 수용체 발현을 하향 조절하여 수용체를 경유하는 하위 신호 전달 경로를 저해하는 것으로 사료된다. 지금까지의 결과를 종합하면 thio-Cl-IB-MECA와 LJ-1888은 A₃AR을 활성화 시켜서 LPS에 매개되는 NF-κB의 활성화를 저해하고 NF-κB에 의해 발현되는 염증성 물질들의 발현을 억제하였다. 아데노신 유도체들은 세포 수준에서 뛰어난 항염증 활성을 가지며 동물 실험에서도 확인할 수 있었으므로 염증성 질환의 치료제로써 적용될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 thio-Cl-IB-MECA의 경우, 사람 전립선 암 세포인 LNCaP (AR+) cells 와 PC-3 cells (AR-) 에 대해서도 암 세포 증식 억제 효능을 보였으므로 암의 증식을 지연시키는 암 예방제 또는 암 치료제로써 적용될 수 있을 것이라고 생각된다.