Cardioprotective effect of novel A₃adenosine receptor agonists

Abstract

심장질환의 정확한 원인은 아직 완전하게 밝혀지지 않고 있으나 여러 가지유전적 요인과 환경의 상호작용에 의한 것으로 생각되고 있다. 심장질환에서 심근세포(cardiomyocyte)의 세포고사(apoptosis)와 세포 외 기질(extracellular matrix)의 축적은 심장 질환 시 심근세포의 보상기전으로제시되고 있는 cardiac remodeling의 과정에 있어 중요한 역할을 한다. 또한 허혈/재관류시에 발생하는 ROS와 안지오텐신 II(angiotensin II) 역시 세포 내 ROS 생산을 통하여 세포 증식, 유주, 세포 외 기질 축적 및 세포고사를 유발하는데 심근세포는 산화성 스트레스에 매우 민감하여 ROS에 노출 되면 세포고사가 유도되어 세포의 손실이 생기고, 이에 대한 일종의 보상기전으로 세포의 분화와 섬유화가 촉진되어 심근비대가 발생하여 심장이 수축력을 잃고 정상적인 기능을 수행하지 못하게 된다. 이와 같은 심장 질환에 심보호 작용을 가진 물질로 최근 가장 대두되고 있는 약물이 아데노신이다. 아데노신은 다양한 기능을 가지고 있는 내인성 물질로서, 신체의 스트레스 상태에서 분비되어 세포의 기능을 조절한다. 현재까지 밝혀진 아데노신 수용체는 4 종류(A1, A2A, A2B, A₃)가 있으며, 각 수용체는 각각 특이적으로 작용한다. A1 수용체 효현제에 의한 심보호 작용이 잘 알려진 반면, A₃ 아데노신 수용체는 상대적으로 최근에 알려지면서 연구가 미흡한 상태이다. 현재까지 알려진 바로는 A₃는 심근세포고사 억제, 심근의 수축력 강화, 심근비대 억제, 허혈/재관류 손상 억제에 관여하고 비만세포의 A₃는 항염증 반응을 매개한다. 염증반응이 심혈관 질환을 유발하는 주된 매개인자 임을 고려할 때 생체 내 실험에서는 A₃의 심보호 효과가 심장에 대한 직접 보호 작용과 systemic 항염증 반응을 통한 간접작용 등 복합적으로 나타날 것이다. 따라서 본 연구에서는 A₃가 심장세포의 세포고사와 fibrosis에 미치는 직접적 작용을 검색하고자 하였다. 본 연구에 사용한 차세대 A₃ 효현제는 4‘-thionucleoside 유도체, LJ1868 과 LJ1869, 로서 전형적인 A₃효현제인 N6-(3-iodobenzyl)adenosine-5'-N-methyluronamide (IBMECA) 보다 사람의 A₃ 수용체에 대한 결합력과 선택성이 우수한 약물로 본 연구에서는 이 약물과 기존에 심보호 약물로 잘 알려져 있는 A1 효현제인 2-chloro-N6-cyclopentyl-adenosine (CCPA) 의 효과를 비교하여 A₃의 보호효과와 그 기전을 좀 더 정확하게 이해하고자 하였다. 심근세포에 H2O2를 처리함으로써 ROS에 의한 세포고사를 유발하였으며 Ang II와 TGF-β1을 처리하여 심근세포의 fibrosis를 유발하였다. 세포고사에 미치는 A₃의 영향을 알아보기 위해 A₃ 효현제를 전처리 하였으며 PARP와 caspase 3 분절을 western blot으로, annexin V-FITC으로 검색하였다. 심근세포의 세포고사에 미치는 A₃ 효현제의 영향을 CCPA와 비교하였을 때, PARP와 caspase 3 절단이 CCPA와 유사한 정도로 차단되었으며 annexin V 염색 또한 감소하였다. 또한 심근세포의 fibrosis에 관련하여 A₃의 영향을 알아보기 위해 A₃ 효현제 전처리 후 Ang II와 TGF-β1 처리시에 심장 ECM 지표인 collagen I과 fibronectin ED-A이 감소하여 A₃ 효현제가 심근세포의 세포고사와 fibrosis에 보호효과를 나타나는 것으로 증명하였다. A₃ 효현제의 효과가 A₃ 수용체를 경유하는지 알아보기 위하여 심근세포 내 A₃ 수용체 발현을 RT-PCR로 검색하였으며 심근세포 내 A₃ 수용체가 존재함을 보였으며 LJ1868과 LJ1869의 효과가 수용체를 경유하여 나타남을 밝혔다. 결론적으로, H2O2는 세포고사를 유도하여 PARP 분절을 증가시키고 annexin V 염색을 증가시켰으며, 1 μM LJ1868와 LJ1869에 의해 CCPA와 유사한 수준으로 PARP 와 annexin V 염색을 감소시켰다. 또한 Ang II와 TGF-β1에 의해 증가한 collagen I과 fibronectin ED-A는 1 μM LJ1868와 LJ1869에 의해 CCPA와 유사한 수준으로 감소하였다. 본 실험은 A₃ 효현제 인 LJ1868와 LJ1869이 심근세포 고사와 fibrosis에 보호효과를 가짐을 증명 하였으며 A₃ 효현제의 심혈관 질환 치료제로서의 가능성을 제시하고 있다.;Apoptosis and extracellular matrix (ECM) accumulation in cardiomyocytes play important roles in the transition from compensatory cardiac remodeling to heart failure. Angiotensin II (Ang II) induces apoptotic cell death, ECM accumulation, and cell differentiation through reactive oxygen species and transforming growth factor β1 (TGF- β1). Adenosine, released rapidly during cardiac ischemia, is a potent endogenous cardioprotective mediator. Adenosine receptors are subdivided into 4 types: A1, A2A, A2B, and A₃. Cardioprotective effect of A1 adenosine receptor (A1AR) is well established. The exact role of A₃ adenosine receptor (A₃AR) in cardiac apoptosis and ECM accumulation, however, remains incompletely understood. The purpose of the present study was to evaluate the effect of newly synthesized A₃AR agonists, 4’-thionucleoside analogues, on apoptosis and ECM accumulation in cardiomyocyte as compared with 2-chloro-N6- cyclopentyladenosine (CCPA), a well known A1AR agonist. H9c2 cells, a rat cardiomyocyte were maintained in DMEM with 10% fetal bovine serum and antibiotics. Synchronized cells were stimulated by 10-1000 μM H2O2, 1-1000 nM Ang II, and 10 ng/ml TGF-β1 up to 48 hours. Different concentrations of each adenosine receptor agonist were administered 1 hour before H2O2, Ang II, and TGF-β1. Apoptosis were measured by annexin V-FITC staining, caspase 3 activation, and PARP cleavage. Fibronectin (ED-A) and collagen I expression were measured by western blot analysis. H2O2 increased annexin V staining in a dose dependent manner. Ang II and TGF-β1 significantly increased fibronectin (ED-A) and collagen I protein expression. A₃AR agonists, LJ1868 and LJ1869, inhibited H2O2- induced annexin V staining in a dose dependent manner. Both LJ1868 and LJ1869 at 1 μM inhibited H2O2- induced apoptosis and Ang II- and TGF-β1-induced fibronectin (ED-A) and collagen I upregulation as much as 1 μM CCPA. These results demonstrated that A₃AR plays a protective role in apoptosis and ECM accumulation in cardiomyocytes and suggest A₃AR agonists as new cardioprotective agent.