Antisense Gene Delivery to Human Ovarian Cancer Cells using L-Arginine-Grafted-PAMAM Dendrimer

Abstract

A specific and effective strategy is needed to treat ovarian cancer successfully. EGFR is highly expressed in many solid tumors including ovarian cancer and thus, EGFR antisense gene therapy can be a potential novel therapeutic strategy in the treatment of ovarian cancer. Gene therapy is an attractive alternative therapeutic approach for the treatment of a variety of diseases. Especially, non-viral vectors such as cationic lipid and cationic polymer are receiving increasing attention as a gene delivery carrier which can overcome the problem of viral vectors. Therefore, we investigated in vitro luciferase gene expression efficiency using PAMAM-Arg, one of the cationic polymer, in human ovarian carcinoma cell line, SK-OV3, and the capability to suppress proliferation of human ovarian cancer cells by transfection of EGFR antisense gene using PAMAM-Arg in SK-OV3 cells. To examine the transfection efficiency of the polyplexes formed by plasmid DNA (clone 790) and PAMAM-Arg, luciferase activity was determined at 0/1, 4/1, 6/1 and 8/1 N/P ratios after 2, 4, 6 and 8 hr incubations. The amount of plasmid DNA used for the polyplex formation was fixed at 1 μg at each N/P ratio. In the present study, polyethyleneimine (PEI) 25K was used as a positive control. Transfection efficiency was determined by the measurement of luciferase activity and the data were normalized by the protein concentration. On the basis of the the transfection efficiency test, we performed [³H]thymidine incorporation in SK-OV3 cells to investigate the capability to suppress proliferation of human ovarian cancer cells by transfection of EGFR antisense gene using PAMAM-Arg . After the thymidine added to the SK-OV cells which were treated at N/P ratios 6, 8 for incubation time 8h, the cells were incubated for different times (24, 48, 72 h). Then the degree of proliferation was evaluated by ³H radioactivity with LSC. As a result, the transfection activity was increased with increasing N/P ratios for 2, 4 and 6 hr incubations, and the maximum gene transfection efficiency of PAMAM-Arg was observed at N/P ratio of 8/1 for 6 hr incubation. In addition, in vitro gene transfection efficiency of PAMAM-Arg was much greater than that of PEI, a positive control. PAMAM-Arg showed almost no in vitro cytotoxicity against the SK-OV3 cells up to the concentration of N/P ratio of 8/1(0.459 mg/mL) for all the designated incubation time periods. In case of PEI 25K, significant reductions in cell viability were observed at N/P ratio of 8/1 (0.243 mg/mL) after 4 and 8 hr incubations, respectively. The polyplexes formed by EGFR antisense gene (clone 882) and PAMAM-Arg significantly reduced thymidine incorporation into SK-OV3 cells (p< 0.05 compared with control), suggesting the suppression of cancer cell proliferation. Based on these results, PAMAM-Arg can be a safe promising polymeric gene delivery vector for gene therapy.;난소암은 진행 초기에 발견하기 어렵고 기존의 화학적 치료방법도그 효과가 제한적이며 많은 부작용이 있어 새로운 치료법 개발이 시급한 실정이다. 난소암을 포함한 많은 암세포에는 EGFR(EpidermalGrowth factor Receptor)이 과다 발현되어 암세포 증식에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으므로 이 유전자의 발현을 막으면 암세포 증식을억제할 수 있다. 그래서 본 연구에서는 비바이러스성 유전자 전달시스템 중 새로운 합성 중합체 L-arginine-grafted-polyamidoaminedendrimer (PAMAM-Arg)의 유전자 전달 효율과 안전성을 확인하고,이를 전달체로 사용하여 EGRF antisense gene을 유전자감염 시켰을때 SK-OV3 난소암세포의 증식이 억제되는지 확인하는 실험을 수행하였다. PAMAM-Arg의 유전자 전달 효율을 확인하기 위해 luciferaseexpression plasmid인 DNA790과 PAMAM-Arg을 다양한 N/P (0, 4/1,6/1, and 8/1) 비율로 polyplex를 만든 후, 2, 4, 6, 그리고 8시간 동안SK-OV3난소암세포에 처리했다. Polyplex의 유전자 전달효율은luciferase activity를 측정한 값을 BCA Assay로 측정한 단백질 농도로보정하여 나타냈다. 세포독성은 a sulforhodamine B (SRB) stainingassay로 확인했는데 이 때, 각 실험 결과의 비교를 위한 기준물질은Polyethylenimine (PEI)를 사용하여 동일한 방법으로 실험했다. 유전자 전달 효율 확인 실험의 결과를 바탕으로, PAMAM-Arg을이용해서 EGFR antisense gene을 난소암세포에 유전자 전달시켰을 때암세포의 증식이 얼마나 억제되는지 확인하기 위한 [³H]thymidineincorporation assay를 수행했다. EGFR antisense gene을 포함하는DNA882와 PAMAM-Arg이 N/P 비율 6/1, 8/1로 결합한 polyplex를SK-OV3세포에 8시간 처리하고 24시간 후에 thymidine를 가해서 24,48, 그리고 72시간 3가지 조건으로 각각 배양시켰다. 그리고는 LSC를이용해서 ³H의 방사선량을 측정하여 암세포 증식이 얼마나 억제되었는지 측정했다. 이와 같은 실험결과, PAMAM-Arg의 유전자 전달효율은 polyplex를 2시간, 4시간 그리고 6시간 처리했을 때 N/P 비율이 클수록 증가했고, 전체결과 중 N/P 비율 8/1로 결합한 polyplex를 6시간 처리했을때 유전자 전달 효율이 가장 높게 나타났다. PAMAM-Arg의 안전성을확인하기 위한 세포 독성실험에서 PAMAM-Arg은 농도 0.459mg/mL(N/P 비율 8/1) 까지 거의 독성이 나타나지 않았다. 기준물질인PEI와 비교해보면 PAMAM-Arg은 세포독성은 훨씬 낮으면서 유전자전달 효율은 크게 높게 나타났다. SK-OV3 난소암세포의 증식을[³H]thymidine incorporation assay를 이용하여 측정한 결과PAMAM-Arg을 이용하여 EGFR antisense gene을 전달시켰을 때 난소암세포의 증식이 유의성 있게 억제되었다. 따라서 본 실험에서 사용한 PAMAM-Arg은 안전하고 유전자 전달효율이 높은 효과적인 유전자 전달 시스템으로 기대되며, 향후 난소암을 비롯한 다양한 암치료에 응용될 수 있을 것이다.