Regulation of Ca^(2+)-dependent cleavage of collapsin response mediator protein-2 and changes in viability by calpain and proteasome in PC12 cells

Abstract

Collapsin response mediator protein-2 (CRMP-2)는 신경에서 growth cone-collapse와 neurite outgrowth와 관련하여 중요한 역할을 하는 단백질로 알려져 있다. 그러나 신경세포의 생존과 사멸에서 CRMP-2가 담당하는 역할은 아직 잘 밝혀지지 않았다. 정상적인 상태에서 CRMP-2는 62 kDa의 단백을 나타내게 되는데 허혈 상태를 유발 시킨 이전의 연구에서 CRMP-2가 52 kDa의 단백으로 잘리는 현상이 관찰되었다. 허혈 상태는 세포 내에서 비정상적으로 칼슘의 농도를 증가 시키는데 이러한 비정상적인 칼슘의 증가가 허혈에 의한 신경 손상에서 중요한 역할을 한다. 원래 칼슘은 세포 내에서 여러 신호전달에 관여하는 물질로 세포 생존을 위해 필수적으로 요구되지만, 허혈과 같은 상태에서 세포 내에 비정상적으로 칼슘의 농도가 증가하게 되면 calpain과 같은 세포 사멸에 관련된 여러 효소를 활성화 시키는데 관여하게 된다. 정상적인 상태에서 calpain은 세포질에서 비활성화 상태로 존재하게 되는데 비정상적으로 칼슘이 증가하면 활성화되어 여러 기질들을 자르는데 관여한다. 또한 정상적인 상황에서 세포 내 단백질의 분해와 재생에서 중요한 역할 담당하고 있는 것으로 알려진 proteasome이 A23187처리에 의해 활성이 증가된다는 것이 보고 되었으며 calpain의 활성화는 proteasome과 연관되어 단백질 분해를 증가 시킨다는 것이 보고 되었다. 이번 연구에서는 CRMP-2 절단 현상이 칼슘과 관련성이 있는지를 알아보고 관련성이 있다면 칼슘에 의해 활성이 영향을 받는 것으로 알려진 calpain과 proteasome이 칼슘 ionophore에 의해서 유도되는 CRMP-2의 절단과 연관성이 있는지 살펴보았다. 그리고 신경세포의 생존과 사멸에 관련하여 CRMP-2 절단이 끼치는 영향을 알기 위해 A23187 처리에 의해 감소된 세포의 생존률에 calpain 저해제나 proteasome 저해제를 단독 또는 병용 처리시의 효과를 시험하고 그 결과를 58 kDa의 형태를 유도하는 CRMP-2 절단과 연관시켜 조사하였다. 세포에 A23187을 처리 시 허혈 상태에서 관찰되었던 58 kDa의 절단된 CRMP-2가 관찰되었고 세포 외의 칼슘 킬레이터인 EGTA를 전처리 했을 때 CRMP-2의 절단이 관찰되지 않는다는 것을 발견함으로서 CRMP-2의 절단에 칼슘이 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 이어서 Ca2+ 의존적으로 활성이 조절되는 calpain과 proteasome이 CRMP-2의 절단에 관여하는지를 각 효소의 저해제들을 사용한 실험을 통해 알아보았다. Calpain 특이적 저해제인 calpeptin 전처리에 의해 A23187에 의해 유도된 CRMP-2의 절단이 차단되었으며 A23187 처리 시간 증가와 함께 내인적 calpain 저해제인 calpastatin의 단백 발현이 줄어드는 것을 관찰함으로써 이 실험 조건에서 calpain이 활성화된다는 것을 알 수 있었다. 또한 μ-calpain을 세포 lysate에 직접적으로 처리 시 CRMP-2가 절단되고 calpeptin 존재시 절단이 일어 나지 않음을 관찰하여 CRMP-2 절단에 있어서 calpain이 직접적으로 관여한다는 사실을 확인하였다. 선택적으로 proteasome만 저해 시키는 MG262나 epoxomicin 처리와 NF-κB 저해제 처리 실험으로부터 proteasome 활성과 NF-κB 의 활성화가 A23187처리에 의해 유도되는 CRMP-2의 절단에 관여하지 않음을 관찰하였다. 또한 calpain과 proteasome의 저해제 병용 실험으로부터 CRMP-2의 절단 현상을 유도함에 있어서 calpain와 proteasome 상호 관련성도 발견되지 않았다. 여러 종류의 NF-κB 저해제들 중 Ro106-9920 만이 calpain 활성을 저해하지 않는데도 CRMP-2의 절단이 차단되는 것을 관찰함으로써 NF-κB 활성 자체는 CRMP-2 절단에 영향을 미치지 않으며 calpain과는 독립적으로 CRMP-2의 절단을 조절하는 다른 메커니즘의 존재 가능성을 시사하였다. A23187의 처리는 CRMP-2 절단과 함께 세포 생존률의 감소를 이끌었다. 그리고 A23187에 의한 CRMP-2의 절단을 막았던 calpeptin은 농도 의존 적으로 A23187에 의해 유도된 세포 사멸을 더욱 악화시켰지만 절단을 막는데 영향을 주지 않았던 선택성 있는 proteasome 저해제인 MG262와 epoxomicin은 모든 농도에서 세포 생존률을 개선시켰다. 세포 생존률과 58 kDa의 절단된 형태의 CRMP-2 존재 사이에 연관성을 더 살펴보기 위해 calpeptin과 MG262 또는 epoxomicin을 병용 처리한 실험에서 calpain 저해제와 proteasome 저해제의 병용처리가 A23187에 의해 유도되는 세포 사멸을 더 악화시키지 않고 낮은 농도에서는 오히려 세포 생존률을 개선 시킴을 발견하였다. 절단된 형태가 더 이상의 세포 사멸을 막거나 심지어 세포 생존을 유도하는데 관여할 수도 있을지도 모른다는 추측을 할 수 있다. 그러나 세포 생존에서 58kDa의 정확한 기능적 역할을 알기 위해서는 CRMP-2가 절단되는 정확한 위치와 역할에 대한 후속 실험이 이루어져야 하리라 사료된다.;Collapsin response mediator protein-2 (CRMP-2) plays important roles in both growth cone-collapse and neurite outgrowth. However, the functional roles of CRMP-2 in neuronal cell survival and/or death are largely unknown. It has been previously found that CRMP-2 is specifically cleaved into 58 kDa form under ischemic condition. Ca2+ toxicity plays a central role in ischemic brain injury. Calpain is known to be a Ca2+-dependent protease which is activated during focal cerebral ischemia. It has been shown that proteasome activity is increased by the Ca2+ ionophore A23187 treatment, indicating that protosome activity is also Ca2+-dependent and calpain activation has been reported to cause a proteasome-dependent increase in protein degradation. In the present study, it was examined whether the CRMP-2 cleavage is Ca2+-dependent and if so, whether proteases (calpain and/or proteasome) activities of which are known to be regulated by Ca2+, are involved in the CRMP-2 cleavage induced by treatment of a Ca2+ ionophore in the pheochromocytoma (PC12) cells. In order to examine the role of the CRMP-2 cleavage in neuronal cell survival/death, the calpain and/or proteasome inhibitors were tested for their effects on A23187-induced decrease in cell viability, and the results were correlated with the CRMP-2 cleavage leading to formation of the 58 kDa form. The A23187-induced cleavage of CRMP-2 was inhibited by pretreatment of an extracellular Ca2+ chelator, EGTA, indicating that the CRMP-2 cleavage is Ca2+-dependent. It was observed that the A23187-induced cleavage of CRMP-2 was completely blocked by pretreating with a calpain inhibitor, calpeptin, and the expression level of an endogenous calpain inhibitor protein, calpastatin, was significantly reduced by A23187 in a time-dependent manner. Moreover, when μ-calpain was added to cell extracts, the 58 kDa cleavage form of CRMP was formed, and this calpain-induced CRMP-2 cleavage was almost completely blocked by calpeptin, indicating the direct cleavage of CRMP-2 by calpain. Experiments with MG262 and epoxomicin, which are known as selective proteosome inhibitors without any inhibitory effects on calpain, and NF-κB inhibitors indicate that proteasome activity and NF-κB activation are not involved in CRMP-2 cleavage. These results also suggest that no link between proteasome and calpain might exist in the regulation of CRMP-2 cleavage. Among NF-κB inhibitors tested, only Ro106-9920, which produced no influence on calpain activity, blocked CRMP-2 cleavage, indicating that another unknown mechanism independent of calpain might play a role in CRMP-2 cleavage. The A23187 treatment which induced CRMP-2 cleavage concomitantly decreased cell viability. Calpeptin which strongly blocked the A23187-induced CRMP-2 cleavage aggravated the A23187-induced cell death in a dose-dependent manner, but proteosome inhibitors (MG-262 or epoxomicin) which showed no blocking effect on CRMP-2 cleavage improved cell viability at all concentrations tested. To further confirm the correlation between the existence of the 58 kDa CRMP-2 and cell viability, cells were treated with calpeptin combined with epoxomicin (or MG262). Combination of both calpain and proteosme inhibitors did not show an aggravation of A23187-induced cell death that was observed by treatment of calpain inhibitor only, and even improved cell viability at lower concentrations. Therefore, the cleaved form of CRMP-2 might play a role in inhibiting the process of further cell death and even possibly inducing a survival. In other to know the precise functional role of 58 kDa CRMP-2 in cell survival or death, the cleavage site and cellular function of CRMP-2 should be further characterized.