Muscarinic receptor-mediated Poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation and its effect on sAPPα release

Abstract

The amyloid precursor protein (APP) is a transmembrane protein that produces Aβ peptide, found in the brains of Alzheimer’s disease (AD). APP normally undergoes proteolytic cleavage within the Aβ sequence by α-secretase, liberating a soluble N-terminal fragment (sAPPα) which can promote neuronal cell survival. Gq/11 protein-coupled muscarinic receptors are known to regulate the release of sAPPα produced by α-secretase processing, however, its regulation mechanisms remain to be further elucidated. sAPPα has been reported which release is regulated by PKC, Ca^(2+), PLA2, PKA, and MAPK cascade activated by G protein-coupled receptors (GPCRs) activation. PARP-1 is a highly conserved DNA-binding protein, which catalyzes post-translational modification of protein by poly(ADP-ribosyl)ation. PARP-1 involves in the regulation of DNA repair and gene transcription. PARP-1 induces energy depletion and cell death in stress condition with massive DNA damage. Recently, alternative mechanism of PARP-1 activation via a direct interaction with phosphorylated ERK2 (externally regulated kinase) and IP3-induced Ca^(2+) mobilization in physiological conditions without DNA damage has been reported. Although GPCR activation has been implicated to be able to activate PARP-1 activity, it has not been clearly elucidated. In this study, it was observed that PARP-1 was activated by oxoM, muscarinic receptor agonist, in concentration- and time-dependent manners. Previously our group and other researchers showed that increase in sAPPα release was shown to be also induced by muscarinic receptor activation. The purpose of thesis was to disclose the possible involvement of the muscarinic receptor mediated PARP-1 activation on sAPPα release in human neuroblastoma cells. To pursue the purpose, whether suppression of PARP activation by chemically distinct inhibitors including benzamides (NAM, 3-AB), isoquinolinones (DPQ, DiQ, AiQ) and phenanthridinone derivative (PJ-34) could antagonize sAPPα release enhanced by muscarinic receptor activation. It was observed that all PARP inhibitors tested inhibited sAPPα release enhanced by muscarinic activation in concentration-dependent manners. To investigate whether muscarinic receptor-mediated increase in PARP activity correlates with sAPPα release, PARP activities were measured in the cell extracts of which supernatants were used in measurement of sAPPα. PARP activation by oxoM treatement was shown to be decreased by a PARP inhibitor, AiQ. These results suggest that muscarinic receptor-mediated PARP activation possibly involves the regulation of sAPPα release. It could be speculated that MAPK pathway and IP3- induced Ca^(2+)mobilization might be possibly involved in this muscarinic receptor-mediated PARP activity and sAPPα release although their evidences should be provided. The intracellular transduction pathways which can connect PARP activation and increase in sAPPα release induced by muscarinic receptor activation remains to be further elucidated.;아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursor protein: APP)은 내재성 막 당 단백질 (integral membrane glycoprotein)으로서, Alzheimer disease (AD)에서 대사과정 중 기억력 저하, 인지능력 저하, 주의력 저하, 사고력 저하와 판단력 저하 등의 요인이 되는 아밀로이드 펩티드 (amyloid-β peptide: Aβ)를 생성한다. 이에 반해, 정상적인 세포에서 APP의 대사 과정 중에 생성되는 용해성 아밀로이드 전구단백질 (soluble amyloid precursor protein: sAPPα)은 세포 밖으로 분비되어 세포의 생존, 증식과 부착을 조절하며 신경돌기의 발아 후 생육을 유도한다. APP의 분해과정에 대한 많은 연구가 행해져 왔고, 그 과정에 무스카린성 수용체가 관계한다는 사실이 보고되었으나, 무스카린성 수용체에 의한 sAPPα의 정확한 유리기전에 대해서는 아직 자세히 밝혀져 있지 않다. sAPPα 유리기전은 G protein-coupled receptors (GPCRs) activation 에 의해 시작되는 Ca^(2+), PLA2, PKA, 그리고 MAPK cascade 에 의해서도 조절된다고 보고되었다. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1)은 진핵세포에서 널리 발현되는 nuclear enzyme으로 DNA 손상에 의해 활성화 되어 DNA-binding protein을 poly ADP-ribosylation 시켜 DNA의 전사를 조절하는 것으로 알려져 있다. PARP-1 은 DNA 교정, 유전자 전사에 관여하며 과다활성이 일어날 경우 세포사멸을 유도한다. 최근에 DNA 손상이 없는 정상 생리 상태에서 인산화된 ERK2 (externally regulated kinase) 와의 직접적인 상호작용이나 inositol 1, 4, 5 trisphosphate (IP3)에 의한 Ca^(2+) 이동에 의해 PARP-1이 활성화 될 수 있다고 보고되었다. PARP-1 은 무스카린 수용체 효능제인 oxoM 에 의하여 농도, 시간 의존적으로 활성화 되었으며 sAPPα 또한 oxoM 에 의하여 농도, 시간 의존적으로 활성화 되었다. 무스카린 수용체가 매개하는 PARP-1 의 활성과 sAPPα 의 유리의 가능한 기전을 알아보기 위해 무스카린 수용체 활성화로 인하여 증가된 sAPPα 가 화학적으로 다른 구조를 가진 PARP inhibitor 인 benzamides (NAM, 3-AB), isoquinolinones (DPQ, DiQ, AiQ) 그리고 phenanthridinone derivative (PJ-34)에 의하여 길항되는지 알아보았다. 실험에 사용된 모든 PARP inhibitor 에 의해서 sAPPα 유리는 농도의존적으로 감소되었다. sAPPα 유리와 PARP 활성화간의 상관관계를 살펴보기 위해 sAPPα 측정에 상등액을 사용하였던 세포의 분해물에 AiQ를 처리하자 농도의존적으로 sAPPα 유리가 감소하는 것 관찰하였다. 이 실험결과로부터 PARP 활성 증가와 sAPPα 유리 증가에 관련 가능성이 있다는 사실을 확인하였다. 비록 증거가 확충되어야하지만 MAPK 경로나 IP3에 의해 유도된 칼슘의 이동이 무스카린 수용체에 의한 PARP-1의 활성과 sAPPα 유리에 관여할것이라고 추측된다. 앞으로 PARP 의 활성화와 sAPPα 유리가 연결된 세포 내 신호 전달 기전에 대한 연구가 이루어져야한다. 이러한 무스카린성 수용체의 활성화에 의한 sAPPα의 유리의 조절 과정에 관한 일련의 실험결과들이, AD의 병리 기전을 좀더 명확히 이해하는 데 기여하고 AD의 치료제 개발에 있어서 새로운 지표를 제시할 수 있을 것이다.