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Comet assay를 이용한 화학물질들의 유전독성평가 및 수은의 유전독성 작용기전 연구

Title
Comet assay를 이용한 화학물질들의 유전독성평가 및 수은의 유전독성 작용기전 연구
Authors
권경진
Issue Date
2008
Department/Major
대학원 생명·약학부약학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
PART 1. 수은의 유전독성 작용기전 연구 The genotoxicity of mercury compounds have been investigated with a variety of genetic endpoints in prokaryotic and eukaryotic cells. The mercury ions are positively charged and easily form complexes with DNA by binding with negatively charged centers to cause mutagenesis. Further, the mercury ions can react with sulfhydryl(-SH) groups of proteins associated with DNA replication and alter genetic information. Another mechanism by which mercury damages DNA molecule is via its probable involvement of reactive oxygen species(ROS) and induces DNA strand breaks. In order to investigate whether the DNA damage was induced by mercury, we performed Comet assay. As the result, the DNA damage was significantly increased when it grows dose-dependently and time-dependently in the absence of S9. But it wasn't in the presence of S9. Because of the mechanism of DNA damage induced by mercury is related to ROS, we compared mercury alone-treated group and mercury co-treated with Vitamin C or glutathione group in Comet assay. As the result, the DNA damage induced by mercury was decreased by Vitamin C and glutathione. Co-treated with Vitamin C and glutathione group was the most effective to lowering DNA damage induced by mercury. In order to confirm the DNA damage induced by mercury is related to ROS in actually, we performed ROS assay. As the result, the ROS production induced by mercury was decreased by Vitamin C and glutathione when it declines dose-dependently. And Co-treated with Vitamin C and glutathione group was the most effective to lowering ROS production induced by mercury. In order to study whether that effects of mercury affects the gene level, we performed microarray. When we compared mercury alone-treated group and mercury co-treated with Vitamin C group, differential expression genes were related with ROS is detected in only mercury alone-treated group. The expression of glutathione peroxidase-1 which is related with ROS depletion was decreased in the mercury alone-treated group. Mercury intoxication resulted in reponse to cytochrome P450. In order to confirm this response, we performed Comet assay with SKF-525A is the cytochrome P450 inhibitor. The suppression of the DNA damage induced by mercury in the presence of S9 was recovered the DNA damage when it was co-treated with SKF-525A. Nitric oxide inhibited cytochrome P450 dependent reactions when microsomal preparations were exposed to nitric oxide. To study the effect of nitric oxide, SNP which is a nitric oxide donor or LPS, iNOS inducer, was administered the treatment of mercury. The suppression of the DNA damage induced by mercury in the presence of S9 was recovered by these two reagents. These effects of SNP or LPS on the DNA damage were dose dependent and abolished by concominant treatment with NG-nitro-l-arginine. This effect of NG-nitro-l-arginine, iNOS inhibitor, was abolished by the addition of l-arginine to NG-nitro-l-arginine. Part Ⅱ. Comet assay를 이용한 화학물질들의 유전독성 평가 The Comet assay (single cell gel electrophoresis) is increasingly being used in genotoxicity testing. The advantages of the Comet assay include its applicability to various tissues and/or special cell types, its sensitivity for detecting low levels of DNA damage, its requirement for small numbers of cells per sample, general ease of test performance, the short time needed to complete a study and its relatively low cost. Ostling and Johanson were the first to develop a microgel electrophoresis technique for detecting DNA damage at the level of the single cell. Cells embedded in agarose gel on a microscope slide, the cells were lysed by detergents and high salt, and the liberated DNA electrophoresed under alkali conditions. The migrating DNA was quantitated by staining with ethidium bromide and by measuring the intensity of fluorescence. In order to investigate the genotoxicity with Comet assay, we classified 4 groups of chemical. Twenty test chemicals were evaluated, five each form four classes of compounds: Genotoxic carcinogens (1,2-dibromoethane, glycidol, melphalan, diethylstilbestrol, urethane), nongenotoxic carcinogens (methylcarbamate, o-nitrotoluene, 1,4-dioxane, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, tetrachloroethylene), genotoxic noncarcinogens (8-hydroxyquinoline, emodin, acetonitrile, diallylphthalate, l-ascorbic acid), nongenotoxic noncarcinogens (1,2-dichlorobenzene, D-mannitol, caprolactam, bisphenol A, chlorpheniramine) Genotoxic carcinogens (1,2-dibromoethane, glycidol, melphalan, diethylstilbestrol, urethane) were increased DNA damage in the absence and in the presence of S9. Methylcarbamate and o-nitrotoluene were increased DNA damage in the presence of S9. 1,4-Dioxane and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin were increased DNA damage in the absence and in the presence of S9. Tetrachloroethylene wasn't increased DNA damage in the absence and in the presence of S9. genotoxic noncarcinogens (8-hydroxyquinoline, emodin, acetonitrile, diallylphthalate, l-ascorbic acid) were increased DNA damage in the absence and in the presence of S9. 1,2-dichlorobenzene was increased DNA damage in the presence of S9. D-mannitol and caprolactam, bisphenol A, chlorpheniramine weren't increased DNA damage in the absence and in the presence of S9. 1,2-Dibromoethane, glycidol, melphalan, diethylstilbestrol, urethane, 1,4-dioxane, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, 8-hydroxyquinoline, emodin, acetonitrile, diallylphthalate, l-ascorbic acid are positive in Comet assay. Methylcarbamate, o-nitrotoluene, 1,2-dichlorobenzene are positive only in the presence of S9 in Comet assay. Tetrachloroethylene, D-mannitol, caprolactam, bisphenol A, chlorpheniramine are negative in Comet assay.;PART 1. 수은의 유전독성 작용기전 연구 수은은 진핵세포와 원핵세포 모두에서 다양한 유전독성 실험 결과 유전독성이 있다고 알려져 있으며 유전 독성이 나타나는 기전은 복합적이다. 양이온인 수은 이온이 직접적으로 음전하를 띠는 DNA에 결합하면 변이원성을 유발할 수 있고, DNA 복제와 관련된 단백질의 술프히드릴기(-SH)과 반응해 DNA에 변이를 일으킬 수 있으며, 활성산소(ROS)생성으로 DNA 가닥을 파손시키는 것이다. 먼저, 수은이 DNA 손상을 유발하는 지 알아보기 위하여 대사활성 부재 하와 존재 하에서 Comet assay를 실시했으며 그 결과, 대사활성 부재 하에서는 농도 의존적이고 투여 시간에 따라 그 독성이 증가하였으며 대사활성 존재 하에서는 농도나 시간에 관계없이 독성이 나타나지 않았다. 수은이 DNA 손상을 일으키는 기전이 활성산소(ROS)와 관련지어 있으므로 대표적인 항산화제로 알려진 Vitamin C와 글루타티온을 병용 처치하여 Comet assay를 실시한 결과, 두 가지 물질 모두 수은에 의한 DNA 손상을 감소시켰으며 Vitamin C와 글루타티온을 함께 처치했을 때 그 감소효과가 더 컸다. 이러한 작용이 활성산소(ROS)의 생성에 실제적으로 영향이 있는 지 알아보기 위해 ROS assay를 실시한 결과 수은에 의한 활성산소의 생성이 농도 의존적이고 투여 시간에 따라 점차 증가했으나 Vitamin C와 글루타티온을 처치했을 때 활성산소의 생성이 다시 감소하였다. 이 결과도 Comet assay와 마찬가지로 Vitamin C와 글루타티온을 동시에 투여했을 때 각각 투여한 경우와 비교해 감소효과가 더 컸다. 이러한 결과가 유전자 수준에서도 영향을 미치는 지 알아보기 위해서 Microarray를 실시하여 수은을 단독 처치했을 경우와 수은과 Vitamin C를 병용 처치한 경우를 비교했을 때 수은을 단독으로 처치한 경우에만 활성산소와 관련된 유의 유전자가 검출되었다. 활성산소를 없애는 것으로 알려진 글루타티온 과산화효소-1의 발현이 감소하였다. 수은은 cytochrome P450와 반응하여 무독화된다고 알려져 있다. 이를 확인하기 위해 cytochrome P450 억제제인 SKF-525A를 병용처치한 결과, 수은이 대사활성 존재 하에서 무독화되었다가 대사효소를 억제하자 다시 DNA 손상을 일으켰다. 또한 cytochrome P450을 억제시킨다고 알려진 일산화질소의 영향을 알아보기 위해 세포 내 일산화 질소를 발생시키는 SNP와 LPS를 병용 처치해 본 결과 SNP와 LPS 농도 의존적으로 수은의 DNA 손상이 다시 증가했으며 일산화질소 생성을 감소시키는 NG-nitro-l-arginine을 첨가해 본 결과 DNA 손상이 감소하였다. NG-nitro-l-arginine에 의한 효과는 iNOS기질인 l-arginine의 첨가에 의해 사라졌다. PART 2. Comet assay를 이용한 화학물질들의 유전독성 평가 유전독성 시험법 중, COMET assay는 처음 Ostling과 Johanson (1984)에 의해 각각의 세포 수준에서의 DNA 손상을 직접 확인하기 위해 도입된 microgel electrophoresis 방법으로 방법이 비교적 간단하고 소요 시간이 적고 눈으로 직접 확인해 볼 수 있으며 각각의 단일 세포에서 결과를 얻을 수 있다. 세포 핵 내에 supercoiled되어 있는 DNA를 lysis시키면 핵단백질이 빠져나가 nucleoid상태가 되며 DNA 가닥에 손상이 있는 경우 알칼리 상태에서 DNA 가닥이 분리되어 음극이 노출된다. 이로 인해 전기영동시 이동되어 tail의 형태를 보여 DNA 손상여부를 눈으로 쉽게 관찰할 수 있다. 손상 정도는 tail DNA 양을 고려하여 tail moment값으로 측정한다. 본 연구에서는 유전독성 시험법에서 표준 세포주에 속하는 L5178Y 세포를 이용하여 본 실험에 들어가기 전 예비독성시험을 거쳐 공비2로 3단계의 농도를 결정하여 대사활성 존재 하와 부재 하에서 실험을 수행하였다. 본 연구에서는 이미 알려진 유형별 유전독성 물질들을 대상으로 유전독성시험법이 Comet assay에 대한 타당성 검증을 실시하였다. 유형은 크게 네가지로 나뉘어 유전독성 발암물질(genotoxic carcinogen), 비유전독성 발암물질(nongenotoxic carcinogen), 유전독성 비발암물질(genotoxic noncarcinogen), 비유전독성 비발암물질(nongenotoxic noncarcinogen) 총 20 여종의 화합물을 대상으로 실험을 실시하였다. 실험 결과, 유전독성 발암물질인 1,2-dibromoethane, glycidol, melphalan, diethylstilbestrol, urethane은 대사활성 여부와 관계없이 모두 양성으로 판정되었다. 비유전독성 발암물질 중 methylcarbamate와 o-nitrotoluene는 대사활성 존재하에서만 양성이었으며 1,4-dioxane과 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin은 대사와 관계없이 양성이었고 tetrachloroethylene은 대사와 관계없이 모두 음성이었다. 유전독성 비발암물질인 8-hydroxyquinoline, emodin, acetonitrile, diallylphthalate, l-ascorbic acid는 모두 대사활성에 관계없이 모두 양성이었으며 비유전독성 비발암물질 중 1,2-dichlorobenzene은 대사활성 존재하에서만 양성이었고 D-mannitol, caprolactam, bisphenol A, chlorpheniramine은 대사여부와 관계없이 모두 음성이었다. 이상의 결과는 3번의 반복을 통해 재현성이 검증되었다.
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