유전자 프로파일 분석을 통한 발암성 · 유전독성 Biomarker 연구

Abstract

In the present study, microarray analysis of L5178Y cells that were treated with twenty test compounds using Mouse Genome 430 2.0 Array in order to find out biomarkers for genotoxicity and carcinogenic toxicity. Twenty test compounds were consist of four classes, such as genotoxic carcinogens, genotoxic noncarcinogens, nongenotoxic carcinogens, and nongenotoxic noncarcinogens. Genotoxic carcinogens are 1,2-dibromoethane, glycidol, melphalan, diethylstilbestrol and urethane. Genotoxic noncarcinogens are 8-hydroxyquinoline, emodin, acetonitrile and diallylphthalate, L-ascorbic acid. Nongenotoxic carcinogens are methyl carbamate, o-nitrotoluene, 1,4-dioxane, tetrachloroethylene and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo -p-dioxin. And nongenotoxic noncarcinogens are D-mannitol, 1,2-dichlorobenzene, caprolactam, bisphenol A and chlorpheniramine maleate. Based on MAS 5.0 analysis, common gene expression profiles change over 2-fold (p-value<0.05) were identified by Global normailzation and Quantile normalization. However based on RMA analysis, few common gene expression profiles change over 2-fold (p-value<0.05) were identified over 2-fold change, below p-value 0.05. Therefore robust multi-array analysis (RMA) and the MAS 5.0 algorithm were used for search common gene expression profile change in response to test chemicals by using 1.5-fold as a cut off. Melphalan, diallylphthalate, bisphenol A out of twenty test chemicals showed common gene profile from both RMA and MAS 5.0 algorithm analysis. We have analyzed using the top-scoring pair (TSP) classifier, and identified Caskin 1/Nol 3 pair as genotoxic biomarker using carcinogenic chemicals. Based on MAS 5.0/Ontology and RMA/GO Tree analysis, we have found out that MAPK pathway signaling pathway was seems to be carcinogenic toxicity, and natural killer cell mediated cytotoxicity seems to be related to genotoxicity. In summary, this study showed Caskin 1/ Nol 3 pair and cellular signaling pathway could be a biomarker for genotoxicity and carcinogenic toxicity, respectively.;본 연구에서는 Microarray 신기술을 이용해 화학물질에 의한 유전자 손상시 반응하는 유전자 프로파일을 지표로 사용하여 유전독성 및 발암성을 검출할 수 있는 새로운 유전독성 대체시험법을 개발하고자 하였다. 유전자 칩(GeneChip) system은 Mouse Genome 430 2.0 array (Affymetrix)를 선정하였다. L5178Y mouse lymphoma 세포에 20 종의 시험물질을 처치한 후, total RNA를 분리하여 다음의 4가지 그룹으로 나누어 그룹의 특징적인 유전자 발현을 보이는 바이오 마커를 찾아 보았다. 시험물질을 처치한 sample을 Microarray 실험을 통해 얻은 data를 가지고 다양한 방법으로 분석해 검증해보았다. 유전독성-발암성 시험물질에는 1,2-dibromoethane, glycidol, melphalan, urethane, diethylstilbestrol이 있었다. 유전독성-비발암성 시험물질에는 8-hydroxyquinoline, emodin, acetonitrile, diallylphthalate, L-ascorbic acid가 있었다. 비유전독성-발암성 시험물질에는 methylcarbamate, o-nitrotoluene, 1,4-dioxane, tetrachloroethylene, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin이 있었다. 그리고 비유전독성-비발암성 시험물질에는 D-mannitol, 1,2-dichlorobenzene, caprolactam, bisphenol A, chlorpheniramine maleate가 있었다. MAS 5.0분석법을 이용하여 Global normalization과 Quantile normalization후에 fold change 2배 이상, p-value 0.05이하에서 공통적으로 나타나는 유전자 프로파일을 얻었다. 그리고 RMA분석법을 이용하여 fold change 2배 이상, p-value 0.05이하에서 나타나는 유전자 프로파일은 시험물질에 따라서 수가 적은 경우가 많아서 fold change를 1.5배 이상으로 낮추어 데이터를 얻었다. MAS 5.0와 RMA 분석법을 이용한 결과에서 Melphalan, diallylphthalate, bisphenol A를 제외한 나머지 시험물질에서는 공통적으로 유의하게 변하는 유전자가 없었다. 그래서 새롭고 간편하지만 성능이 좋은 방법인 TSP(Top Scoring Pair) classifier를 이용하여 분석하였다. 그 결과 Caskin 1과 Nol 3가 발암성 존재하에 유전독성의 biomarker로써 확인되었다. 그리고 MAS 5.0분석법을 이용하여 도출된 Gene Ontology와 RMA 분석법을 이용하여 그린 GO Tree에서 공통되는 pathway는 다음과 같았다. 발암성에 관련해서는 MAPK pathway signaling pathway 유전독성에 관련해서는 natural killer cell mediated cytotoxicity 가 특징적으로 나타났다. 이번 연구를 통해서 Caskin 1/ Nol3의 pair 와 cell signaling pathway는 각각 유전독성과 발암성에 대하여 좋은 바이오마커가 될 수 있음을 알 수 있었다.