Ricini semen extract as a calpain and cathepsin inhibitor developed by screening of chemical library

Abstract

Calpains are calcium dependent cytosolic proteases that play key roles in intracellular signaling cascades and mediators of calcium-induced neuronal degeneration. The Aβ 1-42 peptides, acting with other influences such as glutamate and free radicals, cause an increased or unregulated entry of calcium into affected cells, which leads to the activation of calpains. Activated calpain-1 directly cleaves p35 to release p25. Conversion of p35 to p25 causes prolonged activation and mislocalization of cdk5. p25-activated cdk5 probably results in hyperphosphorylated tau, which probably leads to neurofibrillary tangle formation and neurodegeneration in Alzheimer's disease (AD). With this reason, the calpain-mediated p35 cleavage pathway may serve as a therapeutic target for AD. Overactivated calpain, acting with other influences such as free radicals, can also compromise lysosomal membrane integrity, leading to cathepsin-B, -L and -D leakage, which can activate the apoptosis-mediating caspases. Interestingly, caspase-3 and calpain-1 and -2 can synergistically attack several common or related cytoskeletal, cytosolic and nuclear substrates. Therefore, the combined use of both calpain and cathepsin inhibitors provided additive neuroprotection. However, the known calpain inhibitors discovered so far have not been successful for any clinical usage for AD or other neurodegenerative diseases due to their underprivileged effectiveness, poor selectivity to other cysteine proteases and insufficient stability. Therefore, we facilitated a high throughput screening system and profiled small molecular chemical libraries (~5,000 compounds) to discover novel calpain inhibitor as a potent drug-like compound for AD. The fluorimetric calpain assay with fluorescence-based probe was utilized. The substrate used in the study was designed to possess the calpain-cleavage site in p35. In the presence of calpain-1, the substrate was cleaved to increase fluorescence intensity that was directly proportional to calpain activity. Individual compound of the library seeded in 96-well microplate was tested for calpain-1 inhibitory activity. Among 5,000 compounds, undecylenic acid (UDA) extracted from Ricini semen was chosen for further study due to its non-toxicity and potency as calpain inhibitor. UDA showed potent neuroprotective efficacy against neurotoxin-induced apoptosis in SH-SY5Y cells. Moreover, UDA markedly mitigated an amyloid plaque formation and distinct morphological changes induced by Aβ 1-42. SAR study of UDA derivatives provided the specific tendency for calpain and cathepsin. Cathepsin-B, -D, -L and -H inhibitory activities of UDA derivatives were tested through fluorimetric assay to check their selectivity and potency. Through this SAR study, CLA was discovered as potent calpain and cathepsin inhibitor. To study the mechanisms underlying the neuroprotective effects of UDA and CLA, several tests were proceeded. UDA and CLA decreased free radical formation induced by H₂O₂ and the elevated level of intracellular Ca^(2+) induced by glutamate in SH-SY5Y cells. UDA and CLA have much better protective effects against H₂O₂-induced neurotoxicity than glutamate. It may be related to their role as antioxidants. This study suggests that UDA and CLA have a neuroprotective effect against glutamate, H₂O₂, and Aβ 1-42-induced neurotoxicity through mechanisms related calpain and cathepsin inhibition. In addition, the inhibitory effect of UDA and CLA against the formation of Aβ 1-42 suggests that UDA and CLA may represent a potential treatment strategy for AD.;Calpain은 세포질에 존재하는 칼슘에 의존적인 단백 분해효소로, 세포내 신호 전달 경로에서 핵심적인 역할을 하며 과도한 칼슘이 유도하는 신경 퇴행 과정에 중개자로서 개입한다. 아밀로이드 베타 펩타이드 (Aβ 1-42)는 glutamate나 free radical 등과 함께 칼슘의 과도한 세포내 유입을 일으키는데, 칼슘이 세포내에 과도하게 유입되면 calpain이 활성화된다. 이렇게 활성화된 calpain은 p35 단백질을 잘라 p25로 만드는데, 이 p25가 cdk5 작용을 잘못된 위치에서 비정상적으로 길게 나타나도록 한다. cdk5의 잘못된 활성 조절은 tau의 과인산화를 일으키고 neurofibrillary tangle을 만들며, 결국 알츠하이머병에서의 뇌 퇴행성 병변을 일으킨다. 이러한 이유로 calpain이 매개하는 p35의 분해 경로는 알츠하이머병의 치료제를 찾는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 또한, 과도하게 활성화된 calpain은 free radical과 함께 리소좀 막을 깨뜨리고 리소좀 안에 있던 cathepsin이 나오게 한다. Cathepsin은 단백 분해 효소중 하나로, 세포 사멸에 핵심적으로 관여하는 caspase를 활성화시키는 역할을 한다. Caspase-3와 calpain-1, -2는 함께 세포 골격이나 세포질, 핵의 다양한 기질을 공격하여 세포의 기능을 저하시키고 세포 사멸까지 유도한다. 따라서 calpain과 cathepsin 저해제를 이용하면 부가적인 신경 보호 효과를 기대할 수 있다. 그러나 이제까지 발견된 calpain 저해제들은 알츠하이머병이나 다른 뇌 퇴행성질환 치료제로서 그다지 성공적이지 못하였다. 왜냐하면 calpain 저해제들은 대부분이 유효성이 작거나 다른 시스테인 단백 분해 효소에 선택성이 약하고, 안정성이 부족하기 때문이다. 본 연구에서는 이러한 단점을 극복하고 calpain에 선택성이 높은 새로운 저해제를 발견하기위해 신속하고 효과적인 선발 시험법을 개발하였다. 이 방법을 이용하여 한국화합물 은행의 다양한 분자 골격을 가진 화합물들을 스크리닝하고, 알츠하이머병에 치료제로 사용가능한 새로운 calpain 저해제를 발굴하였다. 이 calpain 활성 측정 방법은 형광 탐침이 있는 기질을 이용하는데, 이 기질은 calpain에 의해 특이적으로 잘리는 p35안에 존재하는 서열을 가지고 있어 calpain의 활성이 있으면 잘려져 형광 강도를 증가시키고 calpain 활성을 비례적으로 나타낸다. 화합물 은행의 각 화합물들의 calpain-1에 대한 저해 활성이 96-well microplate상에서 측정되었다. 5000여 개의 화합물 가운데, 피마자 추출물인 undecylenic acid (UDA)가 강력한 calpain과 cathepsin inhibitor로서 발견되었다. UDA는 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 신경 독성 물질을 처리하여 세포 사멸을 유도시킨 SH-SY5Y 세포에서 세포의 생존율을 증가시켰다. 그 뿐 아니라, Aβ 1-42에 의한 아밀로이드 plaque 형성과 형태의 변화를 효과적으로 막았다. UDA의 이러한 활성과 구조적인 연관성을 알아보기 위해 UDA 유도체들의 calpain과 cathepsin에 대한 저해 활성 경향을 추가적으로 연구하였다. 형광 탐침을 이용한 calpain과 cathepsin-B, -L, -D, -H에 대한 저해 활성 시험을 통해 UDA 유도체들의 calpain과 cathepsin들 사이의 선택성과 효력을 알아낼 수 있었다. 그 결과 conjugated linoleic acid (CLA)가 우수한 calpain과 cathepsin 저해제로 새롭게 발견되었다. UDA와 CLA는 cathepsin-B를 picomolar 영역에서 비농도 의존적으로 50% 정도 저해하는 놀랍도록 우수한 효력을 나타내었다. UDA와 CLA가 가진 신경 세포 보호 효과의 작용 기전을 밝혀내기 위해 몇 가지 실험을 SH-SY5Y cell 상에서 진행하였다. 우선, free radical 생성 측정실험에서 H₂O₂에 의한 빠르고 급격한 free radical 생성이 UDA와 CLA를 전 처리했을 때 뚜렷하게 감소하였다. 다음으로 세포 안 칼슘 농도 측정 실험에서는 glutamate에 의해 유도된 세포내 칼슘 농도 증가가 UDA와 CLA를 glutamate와 같이 처리했을 때 줄어들었다. 위의 두 실험 결과를 비교해 보았을 때, UDA와 CLA의 신경 세포 보호 효과는 glutamate에 의한 세포 안 칼슘의 농도 변화보다는 H₂O₂에 의한 free radical 생성에 대해 더 우수하였다. 본 연구에서는 calpain과 cathepsin 저해 효력을 가진 UDA와 CLA이 glutamate와 H₂O₂, 그리고 Aβ 1-42로 인한 신경 세포 사멸에 대해 신경 보호 효과를 가진다는 것을 보였다. 또한 UDA와 CLA가 알츠하이머병 발병의 핵심 요인인 Aβ 1-42에 의한 아밀로이드 plaque 형성을 막는 것도 증명하였다. 이러한 결과들은 UDA와 CLA가 알츠하이머병의 새로운 치료제로서 연구될 만한 가능성을 제시하며, 그 작용 기전에 관한 연구는 알츠하이머병의 발병 체계를 이해하고 치료 전략을 세우는 데 도움을 줄 것이다.