The Relationship between Antioxidant Enzymes and Chronic Myelogenous Leukemia during Imatinib Mesylate Therapy

Abstract

Chronic myelogenous leukemia (CML) is initiated by expression of the BCR-ABL fusion gene product which results from the Philadelphia chromosome translocation in self-renewing, hematopoietic stem cells. Imatinib mesylate (IM) is an inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase and has continued to show remarkable clinical benefits. But, the IM-based therapy has two major obstacles that resistance to IM and relapse of the disease. Therefore it is a very important issue that minimal residual disease detection by molecular or cytogenetic method. Several investigators have recently shown that the BCR-ABL kinase induces production of reactive oxygen species (ROS) and inhibition of ROS decrease the mutagenesis rate of IM resistance. We report here that mononuclear cells (MNCs) from CML patients' bone marrow show decreased expression levels of antioxidant enzymes including PrxⅠ, PrxⅡ, PrxⅥ and GpxⅠwhile the increased level of catalase. Interestingly, the expression level of these enzymes is restored to the level in a normal individual as the result of IM therapy. In addition, it is shown that the expression pattern of antioxidant enzymes in several hematopoietic stem cell lineages changes during maturation in a healthy individual. To examine the cause of alteration in a CML patient, we have tried to develop the method to study the changes of antioxidant enzymes at the single cell level using immunocytochemistry with monoclonal antibodies. Using this method we confirmed that the intracellular expression levels of antioxidant enzymes are various in different hematopoietic lineages. It also has shown that amounts of PrxⅡ and catalase changes in MNCs of CML patients not because the cell population changes. In bone marrow MNCs, regulation of ROS by antioxidant enzymes might be related to the change of BCR-ABL kinase pathway during IM treatment. Understanding the molecular mechanism of changes in antioxidants at the single cell level might be a potent tool to develop more effective new drugs in CML.;만성골수성백혈병(Chronic Myelogenous Leukemia, CML)은 스스로 분열하여 모든 혈구로 분화 가능한 조혈모세포(hematopoietic stem cells)에서 유전자가 변이되어 발생한다. 9번과 22번 염색체 사이에서 cross-link가 일어나면 22번 염색체가 원형보다 짧아지면서 모양이 바뀌는데 이것을 Philadelphia chromosome(Ph)이라 부른다. Ph 염색체는 BCR 유전자와 ABL 유전자의 위치가 fusion되면서 BCR-ABL kinase를 발현한다. 이 kinase는 정상적인 ABL kinase와는 달리 항상 활성화된 상태의 효소로서 세포신호전달 체계를 변이시켜 CML을 발병시킨다. Imatinib mesylate(IM)는 CML의 주요 원인인 BCR-ABL kinase의 inhibitor로서 10년 가까이 환자치료에 사용되어 왔다. 그러나 IM치료방법은 IM에 대한 내성이 발생하는 점, 재발의 위험성이 존재한다는 점이 단점이다. 그러므로 minimal residual disease를 molecular, cytogenetic method를 이용해 탐지해내는 것과 BCR-ABL 이외의 주요 발병 요인을 찾는 것이 중요한 이슈가 되고 있다. 지금까지 보고된 내용 중에 흥미로운 것은 BCR-ABL kinase가 활성산소 생성을 유도하고 활성산소의 발생을 억제시키면 IM에 대한 내성 발생이 감소한다는 것이다. 우리는 본 논문에서 100% Philadelphia 상태인 CML환자의 골수에서 추출한 mononuclear cells에 PrxⅠ, PrxⅡ, PrxⅥ, GpxⅠ을 포함한 항산화효소의 양이 현저히 떨어져있음을 Immunoblot을 통해 확인하였다. 특히 IM치료를 받은 후 0% Philadelphia로 되돌아온 환자 세포에서 이러한 항산화효소들의 발현양이 정상인 수준으로 회복되려는 경향이 있음도 발견하였다. 한편 정상인의 조혈과정에 있는 여러 성숙단계의 세포들에는 항산화효소가 다양한 양으로 존재하고 있었다. 그렇다면 CML환자에서 발견되는 항산화효소의 변화가 단순히 cell population의 급격한 변화에 의한 것이라기 보다는 세포환경의 변화에 기인한다는 것을 확인하기 위해 우리는 세포내 항산화효소의 양을 탐지할 수 있는 Immunocytochemistry방법을 개발하였다. siRNA transfection시킨 HeLa cell을 이용하여 Immunocytochemistry에 사용 가능한 monoclonal antibody들을 선별한 후, 이 방법을 적용한 결과 다양한 성숙단계의 정상 세포들에서 PrxⅡ와 Catalase의 양이 immunoblot처럼 재현됨을 볼 수 있었다. 또한 CML 환자와 정상인의 골수에서 얻은 mononuclear cell을 각각 immunostaining한 결과 myeloid계열로 추정되는 CML 환자의 세포에서 PrxⅡ는 감소한 반면 Catalase는 발현양이 증가한 상태였다. 이상의 실험을 통해 골수의 mononuclear cell에서 항산화효소에 의한 ROS조절은 Ph 염색체의 변화와 관계가 있다는 것을 확인할 수 있었다. IM치료의 불완전함은 역으로는 BCR-ABL이외의 다른 요인이 CML 발병에 중요하다는 것을 의미한다. 본 실험은 그 요인의 하나가 항산화효소에 의한 세포내 redox state조절일 수 있음을 뒷받침하고 있다. 앞으로 항산화효소와 BCR-ABL간의 신호전달체계를 명백히 밝혀낼 수 있다면 더 나은 CML치료제 개발의 중요한 발판이 될 수 있을 것이다.