Transduction of Cu,Zn-superoxide dismutase into PC-12 cells using a novel protein transduction domain derived from TCTP

Abstract

Evolution of aerobic organisms that can survive in oxygen-rich environments requires an effective defense system against reactive oxygen species (ROS). While physiological concentrations of ROS in aerobic organisms are beneficial and involve cell signaling pathways and survival from invading pathogens, an unbalanced and elevated concentration of ROS may contribute to the development of various diseases, such as cancer, hypertension, diabetes, atherosclerosis, inflammation, and premature aging. To prevent oxidant damage, cells have evolved antioxidant enzymes, such as superoxide dismutases, catalase, and glutathione peroxidase, as well as nonenzymatic scavengers. The superoxide dismutases (SODs) are the first and most important line of antioxidant enzyme defense system against ROS and particularly superoxide anion radicals. A variety of therapeutic strategies for oxidative damage-associated diseases have been developed to antagonize the oxidative stress. Recently, several small regions of proteins called cell penetrating peptides (CPP) or protein transduction domains (PTD) have been developed as carriers for efficient delivery of various proteins that by themselves cannot enter living cells. Because of their ability to cross plasma membranes, the PTDs provide a powerful tool for studying the functions of proteins, and increase the prospects of using proteins therapeutically. In our group, we found that TCTP has its own protein transduction domain and it can make TCTP possible to cross the cell membrane efficiently. We made 35 different mutant sequences modified from original sequence of TCTP-PTD to enhance its transduction ability. After we performed assays to evaluate their transduction ability and cytotoxicity with FITC-conjugated peptides, the 16th mutant was chosen for the best candidate of the novel PTD for Cu,Zn-SOD. The recombinant fusion proteins expressed and purified in E. coli can enter PC-12 cells in a time- and dose-dependent manner when added exogenously to the culture media. Once inside the cells, transduced Tat-SOD and 16-SOD (16th mutant TCTP-PTD linked SOD protein) proteins were enzymatically active, and the activity of 16-SOD was much higher than that of Tat-SOD when treated with high concentration for longer time. The cell viability of PC-12 cells treated with paraquat, an intracellular superoxide anion generator, was increased by transduced Tat-SOD and 16-SOD. The viability of 16-SOD pretreated cells was 20.3% higher than that treated with Tat-SOD. These results suggest that the transduction of 16-SOD fusion protein may be one of the ways to replenish the Cu,Zn-SOD in the various disorders related to this antioxidant enzyme.;산소호흡을 하며 살아가는 생명체는 산소가 풍부한 환경 속에서 생존할 수 있도록 진화하며 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)를 효과적으로 방어하는 체계를 갖추게 되었다. 산소호흡을 하는 생명체에서 생리학적인 농도의 ROS는 세포의 신호전달체계 (cell signaling pathway)에 관여하며 항원의 침입으로부터 세포를 보호하는 등 유익한 물질로 작용하지만, ROS 농도의 균형이 깨지거나 고농도로 존재할 경우에는 암, 고혈압, 당뇨, 동맥경화, 염증, 조기 노화 등의 다양한 질병의 발생을 유발할 수 있다. 이러한 산화성 손상을 방지하기 위하여 세포는 이를 비효소적으로 처리할 뿐 아니라 superoxide dismutases (SODs), catalase, glutathione peroxidase등의 항산화효소를 가지도록 발달하게 되었다. Superoxide dismutases (SODs)는 ROS로부터의 세포손상을 방지하기 위한 항산화효소 중 첫 번째로 발견된 가장 중요한 효소로서, 특히 superoxide anion radical의 제거를 담당한다. 산화적 스트레스를 상쇄하여 산화성 손상과 관련된 질병을 치료하기 위해 다양한 치료법이 개발되어 왔다. 최근, cell penetrating peptides (CPP) 또는 protein transduction domain (PTD)라고 불리는 짧은 peptide 서열이 개발되어, 살아있는 세포 내로 스스로 투과하지 못하는 다양한 단백질을 효과적으로 전달시키는 전달자 (carrier)의 역할을 하고 있다. 생체막을 투과할 수 있는 능력으로 인해 PTD는 단백질 기능연구의 강력한 도구가 될 뿐 아니라, 단백질을 치료적으로 활용할 수 있는 가능성을 높이고 있다. 본 연구실에서는 translationally controlled tumor protein (TCTP)가 고유의 PTD를 가지고 있어서 효율적으로 세포막을 투과할 수 있다는 것을 밝혔다. 본 연구실에서는 TCTP-PTD 고유의 서열을 변형시킨 35종의 변종 PTD 서열을 만들어 투과 효율을 조사하였다. FITC와 접합시킨 35종 변종 PTD 서열을 이용하여 각 PTD 서열의 세포막 투과능과 세포독성을 조사한 결과, 16번 변종서열이 Cu,Zn-SOD의 투과를 위한 최적의 PTD로 선정되었다. PTD 융합 단백질을 발현하는 벡터를 만들고 이를 E. coli를 이용하여 발현시켜 정제하여 PTD 융합 재조합 단백질을 생산하였다. PC-12 세포 외부의 배양액에 처리한 PTD 융합 재조합 단백질은 시간과 농도 의존적인 방법으로 세포막을 투과하였으며, 16번 서열의 세포투과율이 양성대조서열인 Tat보다 우수하였다. 세포 내로 들어간 재조합단백질은 효소적 활성을 보였으며, 특히 고농도로 장시간 처리한 경우 16-SOD의 활성이 Tat-SOD보다 훨씬 우수하였다. 세포 내 superoxide anion 발생물질인 Paraquat을 처리한 PC-12 세포 또한 투과된 Tat-SOD와 16-SOD를 통해 생존율이 증가하였으며, 역시 `16-SOD를 처리한 세포의 생존율이 Tat-SOD 처리군보다 더 크게 증가하였다. 이러한 결과는 TCTP-PTD 유래의 16번 변종서열과 융합한 16-SOD 단백질의 세포막 투과가 항산화효소와 관련된 다양한 질병에 Cu,Zn-SOD를 보급하는 하나의 방법이 될 수 있다는 가능성을 제시하고 있다.