Nifedipine-sensitive Calcium Channels are Critical for the Modulation of Firing Frequency of Dopaminergic neurons

Abstract

In neurons, voltage-dependent Ca2+ channels (VDCCs), the pathways for the transmembraneous Ca2+ influx, are associated with multifarious neural functions such as neurotransmitter release from nerve terminals. Several Ca2+ channels subtypes (L, N, T and P/Q) have already been characterized at neuronal level, yet more to be investigated. Among them, a high-threshold Ca2+ channel (L-type) has been clearly shown to be sensitive to agonists and antagonists of the dihydropyridine class, like nifedipine, nimodipine, and nitredipine. Interestingly, there are two schools having opposite wiews concerning the effect of dihydropyridine, L-type Ca2+ channel blocker, on the firing frequency of substantia nigra (SN) dopaminergic neurons: nifedipine increases1) or decreases2) their firing rate. To resolve this discrepancy, I re-evaluated the effects of nifedipine on the DA neuronal firing rates, using a whole-cell current-clamp method. In addition, I determined the effects of apamin (Ca2+ activated K+ channel blocker). I found that nifedipine decreased their firing rates, whereas apamin increased them. When both drugs were coapplied, the firing rates of SN DA neurons decreased. Post-hoc analysis revealed that this was a result of simple additive actions of nifedipine and apamin. To investigate the underlying mechanism for the effects of nifedipine on the SN DA neuron of firing rates, I examined how a high-threshold Ca2+ spike (HTS) of SN neurons could be modulated by various channel blockers including nifedipine. Nifedipine (30 M) significantly decreased the HTS firing frequency, suggesting that a dihydropyridine-sensitive high-threshold Ca2+ current be an important determinant for HTS threshold. Neither ω-conotoxin (2 M), K+ channel blockers (4AP and apamin) nor substitution of Na+ with equimolar monovalent cations did alter the HTS frequency. The half-widths of HTS were extended by either 4AP (5 mM) or 15 mM TEA, but not by apamin or nifedipine, indicating the falling phase of the spike consists mainly of 4AP-sensitive and/or TEA-sensitive components. Interestingly, the replacement of Na+ with choline or Li+ widened the duration of single HTS about twice, suggesting the existence of TEA-persistence Na+-activated K+ currents in DA neurons. The presence and importance of Na+-activated K+ currents on modulating firing activity of HTS was confirmed with complete blockage of post-pulse afterhyperpolarization, regardless of holding potentials. Taken for these results, I suggest that dihydropyrine-sensitive L-type Ca2+ channels play a major role in determining firing rates of SN DA neurons, probably through the inhibition of HTS generation. It is quite possible that Ca2+-dependent K+ channel may not recognize the Ca2+ ions coming through the L-type Ca2+ channels. 1. Nedergaard S, Flatman JA, and Engberg I. (1993) J Physiol. 466:727-747. 2. Mercuri NB, Bonci A, Calabresi P, Stratta F, Stefani A, and Bernardi G. (1994) Br J Pharmalcol. 113:831-838.;뉴런에서 Ca2+ 이 세포막을 통과하여 세포 내부로 들어가는 이동통로인 전압 의존적인 Ca2+ 채널들은 신경 말단에서 신경전달물질 분비와 같은 다양한 세포 기능에 관여한다. 몇몇의 아류형(subtype) Ca2+ 채널 (L, N, T, 그리고 P/Q) 들의 특징은 신경단위의 수준(neuronal level)에서 이미 정의되어 있지만, 아직 밝혀지지 않은 더 많이 것들에 대한 연구가 계속되어야 한다. 그 중에서 L-타입의 Ca2+ 채널은 nifedipine, nimodipine, 그리고 nitredipine과 같은 dihydropyridine 계열의 효능제(agonist)와 길항제(antagonist)에 민감한 것으로 확실히 증명되었다. 흥미롭게도, substantia nigra (SN) dopamine (DA) 뉴런의 firing 빈도수에 대한 고역치 Ca2+ 채널 (L-타입) blocker인 dihydropyridine의 효과가 두 그룹에 의해 상반되게 보고되어 있다: nifedipine이 firing 빈도수를 증가1)시키거나 감소2)시킨다. SN 뉴런이 기저핵(basal ganglia)에서 스스로의 역할을 수행하는데 Ca2+ 신호전달이 매우 중요하기 때문에 본 논문은 nifedipine이 SN 뉴런의 firing 빈도수에 미치는 영향을 설취류(rat)의 slice를 이용하여 다양한 전기생리학 기법(whole-cell current clamp recording)을 통해 조사하였다. 그 결과 nifedipine이 firing 빈도수를 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다. 반면에 Ca2+ 의존적인 K+ 채널 blocker인 apamin은 firing 빈도수를 증가시켰다. 게다가 두 약물을 동시에 투여하면 firing 빈도수가 nifedipine의 결과를 선호하는 것과 같이 감소하였다. 하지만 변화 정도를 통계적으로 분석해본 결과, 두 약물의 동시투여에 따른 변화는 각각의 약물들이 보인 변화의 단순한 합인 것을 알 수 있었으며, 이 결과를 통해 각 채널이 firing 빈도수에 영향을 미치는 과정이 서로 독립적이라는 것을 제안할 수 있다. Nifedipine이 SN DA 뉴런에서의 firing 패턴에 미치는 효과를 밝혀내기 위한 첫 번째 단계로, 우리는 SN 뉴런의 고전압 역치 Ca2+ spike (high-threshold Ca2+ spikes; HTSs)가 nifedipine을 포함한 다양한 채널 blocker들에 의해 어떻게 변화되는지를 실험하였다. HTS 빈도수가 nifedipine (30 M)에 의해서는 감소하였지만 ω-conotoxin (2 M)에 의해서는 감소하지 않았는데, 이 결과를 통해 dihydropyridine에 민감한 고역치 Ca2+ 전류가 HTS의 역치를 결정하는데 중요하다는 것을 예상할 수 있다. 게다가 K+ 채널 blocker (4AP and apamin)와 Na+를 같은 몰농도의 1가 양이온으로 치환한 것 또한 HTS 빈도수를 변화시키지 않았다. HTS의 반진폭 너비(half width)는 4AP (5 mM) 또는 15 mM의 TEA에 의해 넓어졌지만, apamin이나 nifedipine은 영향을 주지 않는 것을 미루어 보아 spike의 falling phase는 주로 4AP에 민감(4AP-sensitive)하거나 TEA에 민감한(TEA-sensitive) K+ 전류 요소로 구성되어 있다는 것을 암시해준다. 흥미롭게도 Na+를 choline이나 Li+으로 치환한 경우 단일 HTS의 지속시간(duration)이 2배로 증가하였다. 이 결과로 미루어 보아 TEA-persistent Na+에 의해 활성화되는 K+ 전류가 DA 뉴런에 존재한다는 것을 제안할 수 있다. Na+에 의해 활성화되는 K+ 전류의 존재와 이것이 HTS의 firing 활성도를 변화시키는데 중요하다는 것은 막전위과 관계없이 이 전류가 post-pulse afterhyperpolarization을 완벽하게 제거해버린다는 결과로부터도 확인할 수 있었다. 이 실험 결과들을 바탕으로 dihydropyrine에 민감한 L-타입의 Ca2+ 채널이 SN DA 뉴런에서 spike rate을 결정하는데 주요한 역할을 하고 있으며 firing 빈도수의 억제는 아마도 HTS 생성의 억제를 통해 일어난다는 결론지을 수 있다. 또한 Ca2+ 의존적인 K+ 채널이 L-타입을 통해 들어오는 Ca2+을 인식하지 않아서 영향을 받지 않을 가능성도 남아있다. 1. Nedergaard S, Flatman JA, and Engberg I. (1993) J Physiol. 466:727-747. 2. Mercuri NB, Bonci A, Calabresi P, Stratta F, Stefani A, and Bernardi G. (1994) Br J Pharmalcol. 113:831-838.