Induction of Sulfiredoxin by Ethanol and Hypoxia/Reoxygenation

Abstract

Peroxiredoxins (Prx) are a family of peroxidases that reduce hydrogen peroxide and alkyl hydroperoxides to water and alcohol, respectively, with the use of reducing equivalents provided by thiol-containing proteins. In the catalytic cycle of 2-Cys Prx enzyme, to remove hydrogen peroxide, the N-terminal Cys-SH is converted to cysteine sulfenic acid (Cys-SOH), which then reacts with the COOH-terminal conserved Cys-SH to form a disulfide. The active-site cysteine of Prxs occasionally undergoes hyperoxidation to cysteine sulfinic acid (Cys-SO₂H) during catalysis, which leads to inactivation of peroxidase activity. Because hyperoxidized Prxs (Cys-SO₂H) could not reduced by catalytic cycle, sulfiredoxin (Srx) play a key role in reduction and reactivation of sulfinylated Prx. It is well known that oxidative stress produced by various stress leads to organ damages. Under the oxidative stress, the peroxidase activity of Prx is inactivated and it causes various organ damages. So, in this situation, Srx plays a very important key role as a protective device, and it can reduce the damages from oxidative stress. Reactive oxygen species (ROS) is produced by various stressors. In this study, we focused on ethanol-induced and hypoxia/reoxygenation-induced ROS production. In the first part of this study, we observed Srx induction in chronic ethanol fed wildtype mice. But there was no significant increase in ethanol fed Nrf2 -/- mice. Our experimental data said that Srx induction by chronic ethanol feeding is mainly mediated via Nrf2 signaling but LPS is not involved in Srx induction. In the second part of this study, we investigated the mechanism of Srx induction by hypoxia/reoxygenation. In the primary hepatocytes from wildtype mice exposed to hypoxia/reoxygenation induced the level of Srx protein. Using this in vitro system, various chemical inhibitors and primary hepatocyte from various knockout animal models have been studied.Hypoxia/reoxygenation-mediated Srx induction is mainly regulated by Nrf2 signaling pathway. And iNOS is also involved in the Srx upregulation. With primary hepatocytes from iNOS knockout mice, we observed significant decreased Srx induction under hypoxia condition. Our results may explain the underlying mechanism for cytoprotection from oxidative stress induced by chronic ethanol feeding and hypoxia/reoxygenation.;Peroxiredoxin [Prx]는 Thioredoxin [Trx]과 같은 thiol 기로부터 전자를 받아 H₂O₂와 alkyl hydroperoxide를 물과 alcohol로 환원시켜 주는 효소로, 포유동물에서는 총 6종류의 isoform이 있다. N-terminal의 catalytic cystein은 peroxide에 의해 산화가 일어나면서 peroxidase 활성을 잃게 되는데, NADPH와 Trx, Thioredoxin reductase [TR]에 의해 환원되어 reactivation 된다. Catalytic cycle 중에 2- Cys Prx는 Cys-SOH 중 일부가 과도한 산화적 스트레스 상황에 의해 Cys-SO₂H로 과산화 되는데, 이때의 활성을 잃은 과산화 된 Prx를 다시 활성화시켜 세포를 보호하는 기능을 하는 효소가 Sulfiredoxin [Srx]이다. 여러 가지 stress로 인해 생성되는 ROS에 의해 생체는 끊임없이 공격 받게 된다. Prx는 산화적 스트레스에 의해 peroxidase로써의 catalytic activity가 inactivation됨으로써 생체에 여러 가지 손상을 미치게 되는데, 이 때에 Srx가 induction 되어 Prx의 reactivation을 도움으로써 이러한 손상을 완화시켜 줄 수 있는 하나의 보호장치로써의 역할을 할 수 있다. 장기간의 알코올 투여는 여러 세포의 생리학적 기능에 영향을 미쳐 세포와 조직에 손상을 가하게 되는데 이 때 알코올이 간에서 대사되는 과정에서 생성되는 ROS가 원인이 된다는 것은 잘 알려져 왔다. 마우스를 대조군과 실험군으로 나누어 대조군에는 실험군과 동일한 칼로리의 dextran을 투여하고 실험군에는 에탄올을 투여한 후에 간에서 단백질을 분리하여 immunoblot 분석을 통해 Srx의 발현이 에탄올 투여에 의해 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 Srx의 증가는 ROS의한 Prx의 불활성화를 되돌려주며 여러 가지 독성으로부터 조직을 보호하는 데 기여할 것이다. 이러한 단백질 발현 패턴의 변화를 유발하는 메카니즘을 규명하기 위해 항산화 연구에 널리 이용되고 있는 NF-E2 related factor-2 (Nrf2) signaling pathway에 초점을 맞추어 실험하였다. Nrf2는 산화적 스트레스 하에서 cell survival에 관여하는 여러 가지 antioxidant와 phase II detoxification 단백질을 발현시킬 수 있는 cytoprotective gene의 transcription을 조절하는 중요한transcription factor로 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 이러한 Nrf2의 유전자 적중 동물 모델을 이용하여 알코올 투여 실험을 수행하였다. 그 결과 wild type 마우스군에서는 에탄올에 의해 Srx 단백질 발현이 증가하였으나, Nrf2 유전자 적중 마우스군에서는 Srx 단백질 발현의 증가가 현저하게 감소하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 에탄올에 의한 Srx의 발현 증가는 Nrf2 signaling pathway에 의해 일어나는 것임을 짐작할 수 있다. 즉, 에탄올섭취로 인해 생성되는 ROS에 의해 Nrf2가 Keap1에서 떨어져 나와 ARE sequence에 binding하게 되고, 이에 따라 transcription이 activation되고 결과적으로 Srx의 단백질 발현이 증가하게 됨을 알 수 있다. 간에서 알코올 이외의 다른 종류의 스트레스에 기인한 Srx 단백질의 발현 증가를 알아보기 위해 흔히 연구되고 있는 ischemia/reperfusion [IR] 상황을 in vitro system인 hypoxia/reoxygenation 상황으로 재연하여 실험하였다. 또한, 생체 내 간의 상태와 유사한 system으로 실험하기 위해 primary mouse hepatocyte를 이용하였다. 그 결과, hypoxia/reoxygenation 조건 하에서 생성되는 oxidative stress 에 의해 Srx의 단백질 발현이 현저하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 여러 가지 chemical inhibitor와 유전자 적중 마우스의 primary hepatocyte를 이용하여 관련된 메커니즘을 연구한 결과, Nrf2 유전자 적중 마우스에서 hypoxia/reoxygenation에 의한 Srx의 발현 증가가 현저하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었고, iNOS는 여러가지 inhibitor를 이용한 실험과 유전자 적중 마우스를 이용한 실험 모두에서 약간의 감소를 보였다. 이로써, hypoxia/reoxygenation에 의한 Srx의 발현 증가에 있어서 Nrf2 pathway가 major한 역할을 하고 iNOS도 minor하게 관여하는 것으로 짐작할 수 있다.