천식 환자의 말초 단핵구에서 MultiProbe Ribonuclease Protection Assay System을 이용한 다양한 사이토카인의 mRNA 분석기법

Abstract

기관지 천식은 알레르겐에 대한 감작 여부에 따라 아토피성 천식과 비아토피성 천식으로 분류되고 있는데 아토피성 천식의 병태 생리 및 치료에 대한 연구는 활발하게 이루어지고 있는 반면에 비아토피성 천식의 병태 생리에 대해서는 미비하게 연구가 진행되어 온 실정이다. 임상적으로 천식 환자 중 비아토피성 천식 환자의 비율이 비교적 높고 질병의 중증도가 아토피성 천식에 비해 중함을 고려 할 때 비아토피성 천식의 병태 생리에 대한 좀 더 활발한 연구가 진행 될 필요가 있다. 이에 본 보고자는 mRNA를 분석하는 다양한 연구 방법 중 Multi-probe ribonuclease protection assay를 이용하여 아토피성 천식 환자와 비아토피성 천식 환자의 말초 단핵구에서 발현되는 다양한 사이토카인의 mRNA를 비교 분석하였다. 결과는 다음과 같다. 1. 아토피성 환자에서 gel resolution 할 때 냉동고에서 36시간 노출시켰을 때에는 IL-4, IL-2, IL-13, INF-γ의 mRNA 발현을 관찰 할 수 있었고 7일간 노출하였을 때에는 IL-5, IL-9, IL-10의 mRNA 발현을 추가로 관찰 할 수 있었다. 2. 비아토피성 환자에서 36시간 노출하였을 때에는 housekeeping 유전자인 L32, GAPDH의 mRNA 발현만을 관찰했으며 7일간 노출 후에는 IL-2, IL-9, IL-10, IL-13, INF-γ의 mRNA 발현을 관찰 할 수 있었다. 3. 정상 대조인의 말초 단핵구에서는 IL-2, INF-γ의 mRNA 발현만을 볼 수 있었다. 4. 아토피성 천식 환자의 말초 단핵구에서는 IL-4, IL-5의 mRNA 발현을 볼 수 있었으나 비아토피성 천식 환자의 말초 단핵구에서는 그 발현을 볼 수 없었다. 5. 아토피성 천식 환자 및 비아토피성 천식 환자 모두 말초 단핵구에서 IL-2, IL-9, IL-10, IL-13, INF-γ의 mRNA 발현을 볼 수 있었으나 IL-2, IL-13, INF-γ의 mRNA가 아토피성 천식 환자에서 그 발현이 더욱 증가되었다. 천식의 병태 생리는 다양한 세포, 사이토카인, 화학매체 등의 복잡한 상호 작용에 의해 발생되기 때문에 동시에 이들의 발현 및 역할을 규명 할 수 있는 연구 방법이 요구된다. 또한 천식의 분류(아토피성 천식, 비아토피성), 천식의 중증도에 따라 그 병태 생리에 차이점을 보이기에 이들을 동시에 비교 분석해 본다면 천식에 관여하는 다양한 인자들의 역할을 규명하는데 도움이 될 것이다. Ribonuclease protection assay의 한 검체의 전체 RNA에서 동시에 다양한 mRAN를 분석할 수 있는 능력은 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)과 구별되는 장점으로 천식의 병태 생리에 관여하는 다양한 인자의 복잡한 상호 작용을 규명하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 더욱이 Northern blotting에 비해 훨씬 예민하고 분석하고자 하는 RNA가 부분적으로 변형이 돠었어도 측정이 가능하며, 실험 소요 시간이 바교적 짧고 정량적 분석도 가능하다. 이에 본 보고자는 Multi-probe ribonuclease protection assay를 이용하여 천식 환자의 말초 단핵구에서 다양한 사이토카인의 mRNA를 분석해 봄으로써 이 방법이 천식의 복잡한 병태 생리를 규명하는데 유용한 역할을 할 수 있을 것으로 기대한다.;Asthma has been divided clinically into extrinsic and intrinsic variants. Atopic asthma has been extensively investigated. Considerably less information is, however, available about the pathologic characteristics of non-atopic asthma. The aim of this study was to investigate expression of various cytokine mRNA in the peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) from patients with atopic asthma and non-atopic asthma by using Multi-probe ribonuclease protection assay(RPA). Total RNA was isolated from PBMCs in two asthma patients and a non-asthma control. We prepared radioactive probe by using Multi-Probe Template set(hCK-1) and vitro transcription kit. The radioactive probe was added to the RNA sample and the probe seeks out and binds to the target mRNA. The dsRNA hybrids were digested with RNase A and T1. The protected dsRNA and a small sample of the original probe were then separated on a denatured polyacrylamide gel. After electrophoresis, the gel was dried, and radioactive signals were measured. The results were followed. Non asthmatic person showed the only IL-2 and INF-γ mRNA expression. IL-4 & IL-5 mRNA were expressed in the PBMCs from atopic asthma patient, but not in the those from non-atopic asthma patient. Both atopic and non-atopic asthma patient showed IL-2, IL-9, IL-10, IL-13 and INF-γ mRNA expression in PBMCs. However, IL-2, IL-13 and INF-γ mRNA expression were more increased in the atopic patient. Advantages of the multi-probe RPA are its sensitivity and its capacity to simultaneously quantify several mRNA species in a single sample of total RNA. Thus, the RPA is a powerful tool that can be used in a variety of configurations to measure expression of specific mRNA molecules in asthma pathogenesis.