Aspergillus fumigatus KB-1 으로부터 Chitosanase 분리 및 그 특성 연구

Abstract

Chitosan은 게·새우 등 갑각류의 껍질에 다량으로 존재하는 물질인 chitin을 탈아세틸화하여 얻을 수 있는 물질이며, 이것을 가수분해하면 키토산 올리고당으로 된다. 이러한 chitosan이나 키토산 올리고당은 항균성, 항암 활성, 면역 강화 작용, 혈중 콜레스테롤 강하 작용 등 다양한 생리 활성이 있는 것으로 알려져 있고, chitosan의 단량체인 D-glucosamine 또한 최근 관절염 치료의 보조제로서 각광받고 있다. Chitosan 및 키토산 올리고당의 기능성은 분자량이나 탈아세틸화도 등에 따라 서로 다르므로 용도에 따라 적합하게 제조·가공되어야 하므로, 이에 따라 키토산 올리고당의 제조법에 대한 관심이 대두되었고, 현재까지도 연구가 진행중에 있다. 본 연구에서는 Aspergillus fumigatus KB-1으로부터 chitosanase를 순수 분리·정제하여 효소의 일반적인 특성을 파악하고, 그 분해 산물을 분석함으로서 효율적인 키토산 올리고당 생산을 위한 기초 자료를 제공하고자 하였다. Aspergillus fumigatus KB-1 배양액 중에 섞여 있는 chitosanase Ⅰ과 Ⅱ를 DEAE cellulose column, S-Sepharose column, Superdex^(??) 75 column을 이용하여 순수 분리 및 정제하였으며 분리된 chitosanase Ⅰ과 Ⅱ의 분자량은 각각 100.4 kDa과 23.38 kDa 이었다. 분리된 chitosanase Ⅰ의 specific activity는 10.12 U/mg 이었고, chitosanase Ⅱ의 경우는 0.58 U/mg이었다. 분리된 chitosanase Ⅱ의 N-terminal amino acid sequence는 YNLPNNLKQIYDKHKGKXSXVLAKGFTN이었으며 이 결과를 NCBI's BLAST program을 이용해 검색한 결과 Aspergillus sp.에서 분리된 chitosanase에서와 유사한 아미노산 서열이 발견되어 Aspergillus sp.은 그 종류에 관계없이 비슷한 chitosanase를 생산함을 확인할 수 있었다. 두 효소 모두 탈아세틸화도가 높은 chitosan 기질을 더 잘 분해하는 경향을 보여 chitosanase activity를 가짐을 확인할 수 있었다. 반응 시간에 따른 활성 변화를 측정한 결과 chitosanase Ⅰ의 경우 시간이 증가함에 따라, 계속적으로 활성이 증가하는 경향을 띄었으므로 exo-splitting type임을 추측할 수 있었고, chitosanase Ⅱ의 경우 일정 시간이 지나면 더 이상 활성이 증가하지 않는 것으로 보아 endo-splitting enzyme임을 알 수 있었다. ChitosanaseⅠ의 최적 반응 온도는 60℃, 최적 반응 pH는 6.5였으며 chitosanase Ⅱ의 경우 70℃, pH 5.5에서 가장 활성이 크게 나타났다. 두 종류의 chitosanase 모두 10℃에서 가장 안정하였다. Chitosanase Ⅰ의 안정성은 pH 증가에 따라 큰 폭의 감소를 나타냈으나, chitosanase Ⅱ의 경우 pH에 의해 크게 영향받지 않았다. chitosanase Ⅰ은 Bi^(2+), Cu^(2+), Fe^(2+), Fe3+, Hg^(2+), Mn^(2+), Mo^(6+) 그리고 Pb^(2+)에 의해 활성이 큰 폭으로 감소하였으며, chitosanase Ⅱ는 Cu^(2+), Hg^(2+) 와 Mo^(6+)에 의해 활성이 감소하였다. 분리된 chitosanase에 의한 chitosan 분해 생성물 분석을 위해 HPLC와 GPC를 실시하였다. HPLC 분석 결과 chitosanase Ⅰ은 monomer를 주로 생성하였고, chitosanase Ⅱ는 dimer, trimer, tetramer를 골고루 생성하였는데 이중 trimer의 비율이 가장 높았다. GPC를 통해 분해 생성물 전체의 분자량을 알아보았다. 1분부터 32분까지 반응 시간을 달리한 결과 chitosanase Ⅰ은 반응 시간에 비례하여 분자량의 변화가 현저하지 않았던 반면 chitosanase Ⅱ는 반응 시간에 따라 분자량이 뚜렷이 감소하였다. 이 결과를 바탕으로 chitosanase Ⅰ은 exo-cleavage type, chitosanase Ⅱ는 endo-splitting pattern을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이로부터 chitosanase Ⅰ은 glucosamine의 생산에, chitosanase Ⅱ는 키토산 올리고당 생산에 이용될 가치가 있는 효소라고 판단할 수 있었다.

;Chitosan is a poly-β(1→4)-D-glucosamine, which is produced by deacetylation of chitin. Chitosan has many diverse applications such as antifungal, flocculating and hydrating agent. In addition, low molecular weight chitosan oligomers have been found to be useful for lowering blood cholesterol, healing wound, stimulating immune system and treating tumor. Moreover, glucosamine recently came into notice as alternative medicine or adjunct in the treatment of arthritis. Chitosan oligomers have been prepared by acidic hydrolysis in which concentrated hydrochloric acid is employed. An alternative mild method is the use of chitosanolytic enzymes. The chitosanolytic activities have been found in several microorganisms, but most chitosanases from the isolated microorganism hydrolyzed the chitosan to oligomers containing glucosamine monomer. For the production of higher molecular weight oligomers, novel endo-type chitosanase is required. In this study, we described the characteristics of chitosanases from Aspergillus fumigatus KB-1. Two chitosanases produced by Aspergillus fumigatus KB-1 were purified by ion exchange and size exclusion chromatographies. Molecular weights of chitosanases were 100.4 kDa (chitosanase Ⅰ) and 23.38 kDa (chitosanase Ⅱ). The specific activity of chitosanase Ⅰ was 10.12 U/mg and chitosanase Ⅱ was 0.58 U/mg. The N-terminal amino acid sequence of chitosanase Ⅱ was determined as follows: YNLPNNLKQIYDKHKGKXSXVLAKGFTN. The higher the degree of deacetylation, the higher were the activities of chitosanase I and II. These results indicate that the purified proteins are chitosanolytic enzymes. The optimum pHs of the chitosanase Ⅰ and Ⅱ were 6.5 and 5.5, respectively.The optimum temperatures were 60℃ for chitosanase Ⅰ and 70℃ for chitosanase Ⅱ. At 1 mM concentration, chitosanase Ⅰ was significantly inhibited by Bi^(2+), Cu^(2+), Fe^(2+), Fe^(3+), Hg^(2+), Mn^(2+), Mo^(6+) and Pb^(2+), and chitosanase Ⅱ was inhibited by Cu^(2+), Hg^(2+) and Mo^(6+). Hydrolysis products of two chitosanases were analyzed by HPLC. Chitosanase Ⅰ hydrolyzed substrate to glucosamine. Chitosanase Ⅱ produced chitooligosaccharides such as chitobiose, chitotriose and chitotetraose. These results indicate that chitosanase Ⅰ is exo-type enzyme for producing glucosamine and chitosanase Ⅱ is endo-type to produce oligosaccharides. The higher molecular weight distribution of reaction products was analyzed by GPC. Chitosanase Ⅱ markedly lowered the molecular weight as time goes by, but chitosanase Ⅰ had no significant effect on the molecular weight of the substrate. Based on HPLC and GPC analysis results, we might choose chitosanase I for glucosamine production and chitosanase II for chitooligomers.