CALUX bioassay as a highthroughput screening method for dioxins

Abstract

Dioxin-like compounds are ubiquitous environmental pollutants that could be accumulated in biological system through the food chain. These chemicals have been identified worldwide and can have a significant impact on the human health and well being of human and wildlife. Given these issues, the detection and quantification of these chemicals in biological, environmental, and food samples is of paramount importance. However, a typical strategy in testing is time-consuming and expensive, due to exhaustive clean up procedure to remove all the interference and the use of expensive instruments. Two different methods, HRGC/MS chemical analysis and CALUX bioassay were used for testing environmental water and soil samples if CALUX bioassay is applicable for the measurement of dioxin-like compounds. Furthermore, REPs for 17 kinds of dioxin-like compounds were determined and compared with WHO-TEFs of corresponding compounds. i) In the water samples, HRGC/MS-TEQs ranged from 0 to 2.281 pg-TEQ/L, and the highest TEQ value was 2.281 pg-TEQ/L. All samples except one sample showed total-TEQ values below the 1 pg-TEQ/L. HRGC/MS-TEQ values of soil samples was in a range of 0 ∼ 65.6 pg-TEQ/g (dry) and the highest TEQ value was found in Maseo, where the refinery used to be near. OCDD, which has relatively low TEF value, was predominant congener in both water and soil samples. Contribution of OCDD is much higher in soil samples (92%) than in water samples (50%). In the water samples, congener distribution was the order of OCDD, HpCDFs, HpCDDs, HxCDFs and OCDF. However, in the heavily contaminated sample, the major congeners were HpCDFs and HxCDFs. In soil samples, OCDD was the major congener observed in almost of soil samples and followed by HpCDDs, HpCDFs and OCDF. ii) All of the water samples showed minimal effect on the luciferase activity. However, most of the soil samples caused significant luciferase induction. CALUX-TEQs of water samples ranged from 0.7 to 18 pg-TEQ/L and CALUX-TEQs of soil samples ranged from 0.6 to 650 pg-TEQ/g (dry). iii) The correlation between CALUX-TEQs and HRGC/MS-TEQs was very high (r2 = 0.982). However, the absolute values obtained by CALUX bioassay were always higher than that by HRGC/MS. To interpret this data, the REP values for 17 kinds of dioxin-like compounds were determined by CALUX bioassay. And REP values were compared with WHO-TEF values. As increase the numbers of chlorine in PCDD/PCDF chemical structures, REP values become higher than WHO-TEF values. iv) The correlation between estimated REP-TEQs and HRGC/MS-TEQs turned out to be very high (r2 = 0.998) and the absolute values obtained by the analysis of HRGC/MS and estimated based on REP EC50 were appeared to be very similar. And also, there were good correlation (r2= 0.970) between estimated REP-TEQs and CALUX-TEQs. However, the absolute TEQ values obtained by CALUX bioassay were always about ten times higher than the estimated REP-TEQ values. Thus, the CALUX bioassay can be highly recommended as an "early warning system" for routine measurement of dioxin-like compounds in environmental matrices. CALUX bioassay could be used as a screening tool for routine measurement of dioxin-like compounds in environmental matrices because it has great deal of advantages; that is available with smaller sample volume, smaller finance cost, and shorter testing time;다이옥신류 화합물은 환경 중에서 잘 분해되지 않고 잔류성이 강하며 먹이사슬을 통해 축적되어 최종적으로는 인간을 비롯한 생명체에 악영향을 미치는 환경오염물질이다. 또한, 이들 물질은 발암성을 지니고 있고, 급성, 만성, 면역, 유전 등 폭넓은 분야에 강한 독성을 나타내고 있어 관심이 매우 높은 물질 중의 하나이다. 현재 다이옥신류 화합물의 분석은 고분해능 가스크로마토그래피/질량분석법(HRGC/MS)을 이용하여 이루어지고 있는 실정이다. 그러나 이 분석방법은 복잡한 시료의 전처리 과정과 고가의 기기, 숙련된 전문 인력을 필요로 하기 때문에 많은 시간, 노력, 비용을 요구한다. 또한 각각의 이성질체를 분석하여 여기에 다이옥신에 대한 상대적 독성치(TEF, Toxic Equivalent Factor)를 곱해 다이옥신 등가값(TEQ, Toxic Equivalency)으로 환산해야 하므로 이 과정에서 누락되는 다이옥신류 화합물이 있을 수 있어 실제와 차이가 날 수 있다. 따라서, 최근에는 이를 대체할 수 있는 대량검색 (highthroughput screening) 방법으로써 다양한 바이오 분석법이 개발되고 있다. 본 연구에서는 CALUX 바이오분석법의 적용성을 연구하고자 한국의 토양 및 수질 환경시료를 대상으로 HRGC/MS를 이용한 화학분석법과 CALUX법을 이용한 바이오분석법을 활용하여 다이옥신류 화합물을 분석하였다. 더 나아가 현재 화학분석법에서의 분석 대상인 17종의 PCDD/PCDF 이성체에 대하여 CALUX법으로부터 도출된 상대효능치(REP value)와 WHO에서 지정한 TEF 수치를 비교하여 보았다. 또한 두 가지 분석법의 결과를 비교함으로써 다이옥신류 화합물 오염의 초기검색 방법으로써의 CALUX법의 활용 가능성을 평가하였다. 먼저 HRGC/MS분석법으로 환경시료중의 다이옥신류 화합물의 농도 및 이성질체 분포특성을 조사한 결과를 살펴보면, 물 시료의 경우, HRGC/MS-TEQ는 전체적으로 0 ∼ 2.281 pg-TEQ/L의 범위로 나타났고 가장 높은 수치를 보인 시료를 제외한 나머지 물 시료의 TEQ 수치는 1 pg-TEQ/L 이하였다. 토양 시료는 0 ∼ 65.6 pg-TEQ/g (dry) 범위의 TEQ 수치를 나타내었으며, 과거에 근처에 제련소가 위치했던 마서 지역에서 가장 높은 TEQ 수치(65.6 pg-TEQ/g (dry))를 나타냈다. 다이옥신류 화합물의 이성질체 분포특성을 살펴보면, 물과 토양 시료 모두에서 OCDD가 주요 이성질체인 것으로 나타났다. 또한 가장 높은 수치를 보였던 물 시료의 경우, HpCDFs와 HxCDFs가 주된 이성질체로 포함되어 있었다. 두 번째로 CALUX법을 이용하여 환경시료의 다이옥신성 활성(dioxin-like activity)을 측정하였다. CALUX-TEQ 수치를 살펴보면 물 시료의 경우 0.7 ∼ 18 pg-TEQ/L, 토양 시료의 경우 0.8 ∼ 650 pg-TEQ/g (dry)의 범위로 나타났다. 대부분 물 시료의 다이옥신성 활성은 미미한 것으로 나타났으나, 토양 시료의 경우 현저한 다이옥신성 활성을 나타냈다. 이상의 두 가지 분석법으로부터 얻어진 TEQ 수치를 비교해 보았을 때, HRGC/MS-TEQ와 CALUX-TEQ는 매우 높은 상관성을 보였다(r2= 0.982). 그러나 그 절대적인 수치를 비교해보면 CALUX-TEQ 수치가 HRGC/MS-TEQ 수치에 비해 10배 이상 높은 것으로 나타났다. 그 이유를 살펴보기 위해, HRGC/MS 분석법의 대상인 17종의 다이옥신류 화합물에 대하여 CALUX법으로 REP값을 구해보았다. 그 결과, 다이옥신류 화합물의 구조에서 염소기의 수가 많을수록 REP 수치가 WHO-TEF 수치보다 높게 나타났다. EC50에서의 REP값에 근거하여 TEQ 값을 계산한 결과(REP-TEQ), HRGC/MS-TEQ와 CALUX-TEQ 모두와 높은 상관성을 보였다. 절대적인 수치에 있어서 HRGC/MS-TEQ와 REP-TEQ는 비슷하게 나타난 데 반해, CALUX-TEQ값은 REP-TEQ값보다 10배 정도 높게 나타났다. 결론적으로, CALUX 바이오 분석법은 환경매체중의 다이옥신류 화합물을 측정하기 위한 초기검색 도구로써, 다량의 시료를 신속하고 민감하게 검색할 수 있는 "early warning system"으로 적극 활용될 수 있을 것으로 사료된다. CALUX 분석에서 양성으로 판정된 시료에 대해서는 화학분석법을 이용하여 오염원인 물질의 종류 및 농도를 규명하는 연구가 계속 수행되어지면 좀더 과학적이고 신뢰 할 수 있는 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.