TGF-β1 incorporation and surface modification of chitosan based biomaterials for bone regeneration

Abstract

최적의 골재생효과를 얻기 위해서 키토산을 기본재료로 사용하여 복합체의 마이크로그래뉼 형태의 골대체제를 개발하였다. 마이크로그래뉼 형태와 같은 구형의 골대체제는 비구형의 골대체제에 비해서 다양한 형태의 골결손부에 치밀한 충전을 할 수 있는 유연성을 지니고 있기 때문에 3차원 형태의 지지체에 비해서 불규칙인 골결손부를 충진하는데 유리하다. 마이크로그래뉼사이로 형성된 공극으로 골아세포의 이동과 전도를 촉진시킬 수 있다. 제 1부의 연구에서는 키토산을 기본재료로 사용하여 세포외기질 성분(콜라겐) 및 세라믹(트리인산세라믹), 성장인자(형질전환성장인자)를 도입한 골대체제를 개발하여 약물전달시스템으로서의 기능과 골아세포에 대한 지지체로서의 유용성 및 생체내에서 신생골 재생능에 대하여 연구하였다. 제2부에서는 1부에서 연구한 키토산 마이크로그래뉼의 표면에 직접 성장인자 및 RGD 펩타이드를 결합시켜, 생체내 조직반응 및 골전도성의 향상을 목표로 하여, 골아세포의 초기 부착에 대한 영향 및 분화능을 고찰하였다. 키토산 마이크로그래뉼은 키토산 용액, 콜라겐/키토산, 트리인산세라믹/키토산 혼합용액을 수산화나트륨/에탄올 용액에 적가하여 중성이 될 때까지 세척하고 건조하여 제조하였고, 형질전환성장인자는 20mg의 마이크로그래뉼 당 100ng이 함유되게 하였다. 제조된 마이크로그래뉼의 크기는 기존의 골대체제와 비슷한 크기인 350-500μm으로 제조하였다. 분해실험결과, 70일동안 키토산, 트리인산세라막/키토산, 콜라겐/키토산 마이크로그래뉼의 무게는 원래 무게의 92%, 88%, 91%가 잔존하였다. 형질전환성장인자는 초기1일째 속방출이 관찰된 후, 4주동안 키토산, 트리인산세라믹/키토산, 콜라겐/키토산 마이크로그래뉼로부터 1일당 1-2ng의 속도로 유효농도내에서 방출되었다. 골아세포를 마이크로그래뉼에 배양했을 때, 세포의 성장은 28일까지 지속적으로 증가했으며, 그 중 형질전환성장인자가 함유된 마이크로그래뉼에서 세포성장이 가장 높았다. 배양된 골아세포들이 마이크로그래뉼에 부착하여 7일 이후에는 두꺼운 세포층을 형성하는 것을 알 수 있었다. 염기성인산효소의 활성, 골단백질 함량도 배양기간동안 증가하였고, 역시 형질전환성장인자가 함유된 마이크로그래뉼에서 가장 높았다. 가토의 두개골결손부위에서 4주동안 골재생능을 수행한 결과, 특히 형질전환성장인자를 함유한 마이크로그래뉼에서 그렇지 않은 마이크로그래뉼에 비해 높은 골재생능을 확인할 수 있었다. 키토산 마이크로그래뉼은 골형성효과를 향상시키기 위해서 약물조절방출능을 가진 골대체제 및 골아세포배양 지지체로도 이용할 수 있다. 생체재료의 생체적합성은 세포가 부착된 표면과 밀접한 연관이 있어서, 세포의 성장, 분화, 이동에 영향을 준다. 현재 이용되고 있는 생체재료들은 생체적합하고, 무독성이기는 하지만, 주위의 조직과 융합이 충분하지 않은 사례가 많이 보고되고 있다. 제1부에서 연구한 키토산 마이크로그래뉼은 생체적합하고, 염증반응도 심각하지 않으나, 신생골과의 접촉이 매우 뛰어나지는 않았으며, 형질전환성장인자를 방출하는데 있어서 1일째에 함유된 양의 45%의 초기 속방출을 보였다. 형질전환성장인자를 키토산 표면에 공유결합을 형성하여 고정시킨다면, 세포배양기간동안 표면에서 세포에 직접적인 영향을 줄 수 있다. 또한 골결손부에서 골전도성도 향상시킬 수 있을 것이다. 본 연구에서는 키토산 마이크로그래뉼의 표면에 형질전환성장인자와 키토산 필름에 bone sialoprotein에서 유래된 RGD 펩타이드를 각각 결합시켰다. 골아세포를 배양하여 초기세포부착능에 대한 영향을 연구한 결과, 배양후 4시간, 1일째, 형질 전환성장인자와 RGD로 결합된 키토산 표면에서는 결합되지 않은 키토산 표면에 비해 골아세포가 더 많이 신장되었고, 더 많은 수의 골아세포가 부착되어 있음을 확인하였다. RGD가 결합된 키토산 표면은 부착되지 않은 대조군에 비해 섬유아세포와 골아세포를 동시에 배양했을 때, 골아세포에 대해 선택성을 보였다. 또한 골아세포 배양후 14일째 칼슘축적량을 측정한 결과, RGD가 부착되지 않은 키토산에 비해 더 높았다. 위 연구의 결과에서 형질전환성장인자와 RGD로 표면개질된 키토산은 골아세포의 초기 부착 및 분화를 촉진시켰음을 알 수 있었고, 더 나아가 생체내에서 키토산의 조직반응을 감소시키고, 골재생 효과를 증진시킬 수 있는 가능성을 제시하였다.;Chitosan based composite microgranules were developed as bone substitutes. Spherical shaped bone substitutes have greater flexibility in filling different geometric cavity with closer packing than substitutes with nonspherical shapes. Therefore, bone substitutes in a shape of microgranule allow it to fill irregular bone defect easier than three dimensional scaffold. The void spaces formed between microgranules facilitate osteoblasts migration and conduction. In addition, collagen, tricalcium phosphate, and TGF-β1 were added to improve bone regenerative efficacy. Chitosan based microgranules were fabricated by dropping mixed solution into NaOH/ethanol solution. TGF-β1 was loaded into the chitosan based microgranules by soaking microgranules into the TGF-β1 solution. Scanning electron microscopy observation, in vitro biodegradation, and release experiment of TGF-β1 from chitosan microgranules were performed. The size of prepared microgranules was 350-500μm and surface of microgranules was smooth. The average decreases in weight of each chitosan microgranules from first to 70 days were 92%, 88%, and 91% for chitosan, TCP/chitosan, and collagen/chitosan microgranules, respectively. TGF-β1 was released from chitosan, collagen/chitosan, and TCP/chitosan microgranules in therapeutic concentration for 4 weeks. Cell morphologies on the microgranules were examined by SEM and cell proliferation was evaluated using a MTT assay. The differentiated cell function was assessed by measuring alkaline phosphatase (ALPase) activity and osteocalcin assay. Scanning electron microscopic examination indicated that seeded osteoblastic cells were firmly attached to microgranules and proliferated in a multi-layer fashion on chitosan microgranules. The proliferation of osteoblasts on TGF-β1 loaded microgranules was the highest among the microgranules. ALPase activity and osteocalcin content of all samples were increased during culture period and TGF-β1 loaded microgranules significantly higher than other microgranules. In vivo bone regeneration was conducted using rabbit calvarial defect model. Especially, TGH-β1 loaded microgranules demonstrated high bone regenerative capacity in rabbit calvarial defect at 4 weeks in comparison to TGF-β1 unloaded microgranules. Chitosan based microgranules could be utilized as potential bone substitutes with drug releasing function to improve bone forming efficacy and also osteoblasts culture scaffold. Even with significant bone regeneration by TGF-β1 released from chitosan microgranules in part 1, the initial burst release of TGF-β1 still remains to be relieved. If TGF-β1 is immobilized on chitosan surface, TGF-β1 on chitosan surface can directly influence on osteoblastic cells through culture period. It is possible to decrease foreign body reaction and to enhance osteoconduction in vivo. The objective of part 2 was to investigate that on the surface modification of chitosan which might be enhanced on the osteoblastic cells attachment, growth, and differentiation. In this study, chitosan microgranules were modified with biologically active substance such as growth factors (TGF-β1) to improve bone bonding and foreign body reaction. It was also examined the influence of RGD peptide derived from bone sialoprotein (BSP) immobilized to chitosan on osteoblasts. Bone sialoprotein and osteopontin are two noncollagenous proteins that contain RGD regions and bind tightly to hydroxyapatite. Osteoblastic cell attachment on TGF-β1 modified chitosan microgranules and RGD peptide modified chitosan film were assessed after 4 h and 1 day incubation. Cell morphology observation, flow cytometric analysis, and mineralization assay were examined. SEM and confocal microscopy showed that TGF-β1 and RGD peptide modified chitosan enhanced cell spreading compared to non-modified chitosan. RGD peptide modified chitosan film had specificity for osteoblast and exhibited an increase calcium level in comparison with non-modified chitosan surface. These results suggested that chitosan surface can be modified to mimic the noncollagenous ECM of bone by grafting growth factor or RGD and ultimately modulate the osteoblastic cells attachment and differentiation. It is expected that surface modified chitosan microgranules may improve their ability to regenerate bone more efficiently in bone defect and reduce foreign body reaction.