배양 해마절편에서 포도당/산소 고갈과 재관류에 의한 SNARE 및 Complexin의 발현 변동

Abstract

세포외 방출 (exocytosis) 과정에는 시냅스 소포와 시냅스 전막의 융합 (fusion) 및 이후 칼슘 유입에 의한 신경전달물질의 방출 (release) 단계가 필수적이며, 이 중 융합과정에서는 SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 단백질이 핵심적인 역할을 담당한다. 시냅스 전막에 존재하는 synaptosomal-associated protein 25 (SNAP-25), syntaxin과 시냅스 소포 막에 존재하는 vesicle-associated membrane protein (VAMP)는 하나의 복합체를 형성하기 위하여 서로 잡아 당기게 되므로 시냅스 소포가 시냅스 전막과 융합하게 된다. 여기에 complexin이 추가로 결합하면 비로소 완전한 상태의 융합이 일어나게 된다. 따라서 포도당/산소 고갈 및 재관류 유도로 신경전달물질의 방출변동이 발생하면 시냅스 전막과 시냅스 소포의 융합에 큰 역할을 담당하는 SNARE 단백질과 complexin의 변동을 초래할 것으로 추측할 수 있다. 본 연구에서는 최근 뇌신경 손상의 생체외 모델로 각광받고 있는 배양 해마절편을 이용하여 포도당/산소 고갈 및 재관류에 의하여 신경세포 손상을 검색하기 위하여 PI 형광 염색과 MAP-2 면역 형광 염색을 시행하였다. 그리고, 포도당/산소 고갈 및 재관류 동안 나타나는 아연의 변동을 Timm 염색을 통하여 검색함으로써 동반되어 나타나는 흥분성 신경전달물질 방출에 대한 간접적 지표로 삼고자 하였다. 또한 허혈성 손상 시 SNARE 단백질과 complexin의 변동이 나타나는지를 검색하기 위하여 Western blot과 면역 형광 염색을 시행하였다. 신경세포 손상은 30 분간의 포도당/산소 고갈 및 재관류로 인해 CA1과 CA3 부위에서 모두 시간의존적으로 증가하였고, 손상정도는 허혈시 보다는 재관류시에, CA3 부위 보다는 CA1 부위에서 더 심하게 나타났다. 대조군에서 해마의 stratum lucidum에 존재하던 아연이 포도당/산소 고갈 및재관류로 인하여 stratum pyramidale로 이동하였다. 즉, 포도당/산소 고갈 및 재관류로 아연이 시냅스 전막에서 후 시냅스로 이동하였으므로, 아연과 함께 시냅스 소포에 저장되어 방출된다고 알려진 흥분성 신경전달물질인 glutamate 또한 방출이 증가되었을 것으로 예상 된다. 포도당/산소 고갈 및 재관류 동안 SNAP-25와 syntaxin의 면역 형광은 CA1의 stratum radiatum, stratum oriens 부위와 CA3의 stratum lucidum, stratum oriens 부위에서 모두 증가하였고, VAMP와 complexin의 면역 형광은 CA1과 CA3 부위의 피라미드형 세포층에서 모두 증가하였다. 따라서 본 연구에서는 배양 해마절편에 포도당/산소 고갈 및 재관류를 유도하였을 때 신경세포 손상 과정에서 나타나는 과도한 신경전달물질 방출과정에, SNARE 단백질과 complexin이 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. ;The exocytosis requires vesicle and presynaptic membrane fusion and Ca^(2+)-dependent neurotransmitter release. The heart of membrane fusion is the formation of the SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins. Interaction of between two target plasma membrane (t-) proteins, synaptosomal-associated protein 25 (SNAP-25) and syntaxin and a vesicular (v-) protein, vesicle-associated membrane protein (VAMP) produces the SNARE complex to fuse the vesicle with plasma membrane. An additive binding of complexin to the SNARE complex makes the fusion complete and perfect. Thus, while glucose/oxygen deprivation (GOD) and reperfusion triggers the various neurotransmitter release, an alteration of the expression of SNARE proteins and complexin as fusion mechanism may occur. In this study, the level of PI and MAP-2 was measured in organotypic hippocampal slice cultures in order to investigate the extent of neuronal damage during GOD/reperfusion. Timm staining, which can detect the movement of zinc, was used as indirect indicator of excitatory neurotransmitter release during GOD/reperfusion. The alteration of SNARE proteins and complexin level were also measured by Western blot and immunofluorescence staining. During GOD/reperfusion, neuronal damage was observed in CA1 and CA3 areaS in a reperfusion time dependent manner and the extent of neuronal damage in CA1 area was greater than that of CA3 area. In control, zinc was located in the stratum lucidum of CA3 area, and it was observed in the stratum pyramidale during GOD/reperfusion. Because GOD/reperfusion induced the translocation of zinc from presynaptic site to postsynaptic site, it could be supposed that the release of the excitatory neurotransmitter glutamate, which is known to be colocalized with zinc in the same vesicle, might be increased. The immunofluorescence of SNAP-25 and syntaxin was increased in the stratum radiatum and the stratum oriens of CA1 area and the stratum lucidum and the stratum oriens of CA3 area during GOD/reperfusion. In addition, the immunofluorescence of VAMP and complexin was increased in the stratum pyramidale of CA1 area and CA3 area during GOD/reperfusion. Therefore, this study suggests that the SNAREs and complexin play an important role in the neuronal damage and neurotransmitter release in the cultured hippocampal slices during GOD/reperfusion.