플라스미드 유전자를 함유한 리포좀의 제조 및 특성

Abstract

병리적 현상의 회복만으로 치료될 수 없는 유전자 관련 질환(유전자의 결함, 유전자의 부재 등)에 있어서 그 원인 유전자의 결함을 고치거나 부재하는 유전자를 표적부위에 송달하여 발현하게 하는 유전자 치료법은 상당히 획기적인 치료방법이다. 그러나 현재로써는 부작용을 유발하지 않고 보다 효율적으로 유전자를 인체에 직접 적용시키는 데 있어서 여러 가지 문제가 존재한다. 그러므로 본 연구에서는 보다 효과적으로 유전자를 표적부위에 송달하기 위하여 유전자 전달 시스템 개발을 위한 기초 연구를 수행하였다. 이를 위하여 플라스미드 DNA(pGL2 clone 753, ∼5.8kb)를 freeze/thawing 방법으로 리포좀에 봉입시켰으며 이 리포좀은 1-palmitoyl-2-oleyl-glycerol-3-phosphocholine (POPC), didodecyl dimethyl ammonium bromide(DDAB), distearoyl phosphatidyl ethanolamine polyethylene glycol 2000(DSPE-PEG 2000)과 DSPE-PEG 2000-maleimide로 구성되어졌다. 이와 같이 플라스미드 DNA가 봉입된 리포좀은 분출기 내의 2장의 폴리 탄산 에스테르 필터를 통과하여 일정한 사이즈로 조절되었다. 그리고 Sephadex CL-4B 컬럼을 통과하여 리포좀에 봉입된 플라스미드 DNA와 봉입되지 않은 DNA를 분리하였다. 위의 과정을 단계적으로 진행시키며 리포좀 내 플라스미드 DNA의 봉입률을 최적화할 수 있는 조건을 찾는데 주력하였다. 그 결과, 플라스미드 DNA의 양을 달리하였을 때 200 μg까지는 DNA양과 무관하게 거의 일정한 비율의 봉입률을 보였으나 그 이상에서는 봉입률이 다소 감소하는 경향을 보였다. 또한 지질 구성성분 중 양성지질인 DDAB의 양이 증가할수록 DNA 봉입률이 증가하는 경향을 보였다. 뿐만 아니라 리포좀을 구성하는 지질의 농도가 증가할수록 봉입률이 다소 낮아지는 경향을 보였으며 리포좀의 크기가 증가함에도 불구하고 리포좀 내 DNA의 봉입률은 유사하였다. 마지막으로 크기가 다른 세 종류의 플라스미드 DNA(5.8kb인 pGL2 clone 753, 6.8kb인 pSV clone 756, 10.6kb인 pCEP4 clone 790)을 사용하여 플라스미드 DNA의 크기가 리포좀 내 DNA 봉입률에 미치는 영향을 조사한 결과, 크기가 유사한 clone No.753과 clone No.756은 유사한 봉입률을 보였으나 다른 두 종류에 비해 크기가 약 2배 정도 큰 clone No.790의 봉입률은 다소 감소되었다.;The objective of this study was to construct the pegylated liposomes containing plasmid DNA with optimal encapsulation efficiency. Plasmid DNA (pGL2 clone 753, ∼6kb) was encapsulated by the freeze/thawing method into liposomes composed of 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC), didodecyl dimethyl annonium bromide (DDAB), distearoylphosphatidyl ethanolamine polyethylene glycol 2000 (DSPE-PEG 2000) and DSPE-PEG 2000-maleimide. The liposomes containing plasmid DNA were then extruded through two stacked polycarbonate filters with series of different pore sizes to control the liposome size. The plasmid DNA entrapped in the liposomes was separated from free plasmid DNA by Sephadex CL-4B column chromatigraphy. The decreased pore size of polycarbonate filters resulted in the decreased size of liposomes. The encapsulation efficiency was markedly affected by the cationic lipid (DDAB) concentration, but to a low degree by the size of liposomes, by the amount of plasmid DNA, by the amount of lipid and by the size of plasmid DNA.