내독소로 유도되는 Nuclear Factor kappa B 활성화에 미치는 Src family kinase의 조절기전

Abstract

Src family tyrosine kinases (TK)가 내독소로 인해 유도되는 NF-κB 활성화 신호전달체계에 연관되어 있음이 보고된 바 있다. 또한 내독소 (LPS)나 TNFα와 같은 여러 자극제는 IκB-α의 serine 기 또는 tyrosine 기의 인산화를 통하여 NF-κB 를 활성화 시킨다고 알려진바 있다. 따라서 본 연구에서는 RAW264.7 대식세포를 내독소(LPS)에 노출시킨 후 Src TK 가 NF-κB 활성과 염증인자의 생성에 있어서 어떤 역할을 하는지에 대하여 조사하였고 내독소 투여로 인한 NF-κB 활성에 있어서 Src TK 의 기본적인 작용기전에 대해 조사하였다. Damnacanthal 이나 PP1 은 Src TK 특이적 억제제로 알려져 있다. 본 연구에서는 Src TK 의 특이적 억제제인 damnacanthal 이나 PP1 을 사용하였고, RAW 264.7 대식세포에서 Src TK 특이 억제제의 전처치는 내독소로 유도되는 NF-κB 활성을 차단시켰다. 또한 내독소 투여로 증가된 NO 생성은 damnacanthal 이나 PP1 에 의하여 억제되었다. 이런 TK kinase 억제제는 내독소로 유도되는 serine 기 인산화와 IκB-α 분해 그리고 NF-κB 의 subunit 인 p65 가 핵으로 전위되는 것을 억제시켰다. IκB-α의 serine 기 인산화 뿐 아니라, RAW264.7 대식세포에서 내독소로 유도되는 NF-κB 활성화는 IκB-α tyrosine 기 인산화를 필요로 하였다. 또한 damnacanthal 이나 PP1 은 내독소로 유발되는 tyrosine 인산화를 억제하였다. RAW264.7 대식세포를 내독소에 5 분부터 60 분까지 노출시킨 결과 Src TK 인 Lck, c-Src, Lyn 는 활성화 형태로 IκB-α와 직접적으로 연관하고 있음을 보여주었다. 이상의 결과들로 보아 RAW264.7 대식세포에서 내독소 노출로 초래되는 NF-κB 활성화경로가 IκB-α serine 기와 tyrosine 기 모두에 의존적이라는 것을 보여주고 있으며, Lck, c-Src, Lyn TK 가 두가지 다른 NF-κB 활성 기전에서 직접 그리고 간적적 역할을 담당한다고 사료되었다.;Src family tyrosine kinases (TK) have been found to be involved in LPS induction of signal cascades. Furthermore Lipopolysaccharide (LPS) or Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) activate nuclear transcription factor κB (NF-κB) by inducing serine or tyrosine phosphorylation of the inhibitory subunit of NF-κB (IκB-α). In the present study, we investigated the role of Src TK in NF-κB activation and production of nitric oxide (NO) in LPS stimulated RAW 264.7 macrophages and the underlying mechanism by which Src TK play a role in LPS-induction of the possible pathways leading to NF-κB activation. Inhibition of Src TK with damnacanthal or PP1 blocked LPS-induced NF-κB activation at the range of nanomolar concentrations. Substantial inhibition in LPS-induced production of NO was also observed in cells treated with damnacanthal or PP1. These kinase inhibitors blocked LPS-induced the serine phosphorylation, the degradation of IκB-α, and the consequent translocation of p65 subunit of NF-κB to the nucleus. In addition to the serine phosphorylation of IκB-α, LPS-induced NF-κB activation in RAW 264.7 cells also required for tyrosine phosphorylation of IκB-α. Furthermore, Lck, c-Src or Lyn TK was physically associated with IκB-α. This association was observed after 5min of LPS stimulation and sustained through a 60min exposure of RAW 264.7 cells to LPS. These results suggest that the LPS-induced NF-κB pathways are dependent on both serine and tyrosine phosphorylation of IκB-α and Lck, c-Src, and Lyn TK are key components of the LPS signaling pathway by at least two different mechanisms of NF-κB activation.