나환자에서 RAGE와 EN-RAGE 단백 발현에 관한 연구

Abstract

RAGE (receptor for advanced glycation endproducts)는 AGE (advanced glycation endproducts)와 베타 아밀로이드, 암포테린, S100/ calgranulin 등 여러 리간드 (ligand)와의 상호작용을 통해 당뇨합병증과 관상동맥질환, 알츠하이머병, 아밀로이드증 및 종양의 성장과 전이에 관여한다. RAGE의 리간드 중 하나인 EN-RAGE (extracellular newly identified RAGE binding protein)는 S100 단백 family에 속하며 호중구와 단핵구에서 발현되고 림프구에서는 발현되지 않는다. 세포외로 분비된 EN-RAGE는 강력한 화학주성을 가지며 대식세포나 림프구, 혈관내피세포 표면에 발현된 RAGE와 결합하여 NF-kB와 같은 하부신호전달체계를 활성화함으로써 TNF-α와 IL-1β의 분비를 유도하고 지연형 과민반응에도 관여한다. RAGE와 EN-RAGE의 상호작용이 염증반응과 지연형 과민반응에 관여할 수 있으나 나균에 의한 만성 육아종성 감염질환인 나병에서 RAGE나 EN-RAGE 발현에 대해서는 현재까지 알려진 바 없다. 본 연구는 나병에서 RAGE와 EN-RAGE 발현 여부를 알아보고 RAGE와 EN-RAGE 상호작용이 만성 염증반응에 의해 초래되는 조직 손상에 관여하는지 알아보고자 하였다. 나병과 유사하게 조직 내에 육아종이 형성되고 미코박테리움 감염과 관련이 있는 비정형 미코박테리움 감염증 및 피부 유육종증에서 RAGE와 EN-RAGE의 발현여부와 발현양상을 나병과 비교하여 알아보고자 하였다. 이를 위해 피부조직을 이용한 면역조직화학 염색 및 공초점 레이저 주사현미경 관찰과 나환자 혈청을 이용한 효소면역측정법을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. RAGE 발현 세포의 수가 다균나군 176.13 ± 85.65, 희균나군 53.89 ± 35.08, 비정형 미코박테리움 감염군 1.85 ± 2.54, 유육종군 1.44 ± 1.67로 다균나와 희균나군이 비정형 미코박테리움 감염군과 유육종군에 비하여 유의하게 높게 발현되었다 (p<0.01). 다균나군은 희균나군보다 RAGE발현이 유의하게 높게 관찰되었다 (p<0.01). 다균나조직 중 나반응이 없는 환자군에서 RAGE의 발현이 높았으며 (p<0.05) 희균 나환자군에서는 나반응의 유무에 따른 RAGE발현 차이는 관찰되지 않았다. 비정형 미코박테리움 감염증과 유육종증에서는 RAGE가 거의 발현되지 않았으며 두 군 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 2. EN-RAGE 발현 세포의 수가 다균나군 84.43 ± 50.23, 희균나군 58.56 ± 39.52, 비정형 미코박테리움 감염군 54.57 ± 39.86, 유육종군 17.22 ± 16.43으로 다균나와 희균나군, 비정형 미코박테리움 감염군에서 유육종군에 비하여 유의하게 높게 발현되었다 (p<0.01). 다균나군, 희균나군 및 비정형 미코박테리움 감염군 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 다균나군과 희균나군 모두에서 나반응의 유무에 따른 EN-RAGE발현 차이는 관찰되지 않았다. 3. 나조직의 RAGE와 EN-RAGE 중복 염색 결과 RAGE와 EN-RAGE는 동일 세포에서 발현되었다. CD68과의 중복 염색 결과 RAGE와 EN-RAGE는 CD68 양성인 대식세포에서 발현되었다. 4. 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였을 때 나환자의 피부조직에서 RAGE와 EN-RAGE 단백이 발현되었으며 동일 세포의 세포표면을 따라 두 단백이 동시에 발현되었다. 5. 효소면역측정결과 다균나군과 희균나군 환자 혈청에서 RAGE는 측정되지 않았다. 6. 혈청내 EN-RAGE의 흡광도는 다균나군에서 0.84 ± 0.40, 희균나군에서 0.76 ± 0.44로 측정되었으며 두 군 사이에 통계적 차이는 관찰되지 않았다. 7. 희균나 군에서 나반응이 있는 환자는 나반응이 없는 환자보다 혈중 EN-RAGE가 유의하게 높았으며 전체 나환자 중 나반응이 있는 환자가 나반응이 없는 환자보다 혈중 EN-RAGE가 유의하게 높았다 (p<0.05). 다균나 환자의 경우 나반응의 유무에 따른 혈중 EN-RAGE는 차이를 보이지 않았다. 본 연구 결과 염증반응 유발에 관여하는 수용체-리간드 복합체인 RAGE와 EN-RAGE가 나조직에서 발현되어 서로 상호작용을 나타내었고다균 나군에서 희균나군보다 RAGE와 EN-RAGE 발현이 높았으며 나균에 대한 과민반응으로 간주되는 나반응이 있을 때 혈중 EN-RAGE의 발현이 증가함을 관찰하였다. 이는 RAGE와 EN-RAGE의 상호작용이 나균에 대한 항균작용을 하기보다는 나병의 염증성 반응을 매개함을 시사하므로 RAGE와 EN-RAGE간의 상호작용을 차단함으로써 염증반응의 초기단계를 억제하여 나병과 나반응에서 염증성 반응과 이에 따른 조직손상 및 합병증을 최소화할 수 있을 것으로 생각된다. ;RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) is a member of immunoglobulin superfamily and implicated in the pathogenesis of diabetic complications, alzheimer's disease, amyloidosis, tumor invasion and metastases interacting with its ligands such as AGE (advanced glycation endproducts), beta-amyloid, amphoterin, S100/calgranulin, etc. EN-RAGE (extracellular newly identified RAGE binding protein), a ligand of RAGE, is expressed on human neutrophils and monocytes, but not on lymphocytes. Its ligation with cellular RAGE on endothelium, mononuclear phagocytes, and lymphocytes triggers cellular activation, with generation of key proinflammatory mediators, IL-1β and TNF-α. The purpose of this study is to investigate the RAGE and EN-RAGE expression in leprosy lesions by immunohistochemical stain comparing with sarcoidosis and atypical mycobacterial infection, to investigate the spatial colocalization of RAGE and EN-RAGE and their interaction by confocal laser scanning microscopic examination, and to measure the level of RAGE and EN-RAGE in the serum from leprosy by ELISA. The results are summarized as follows: 1. RAGE expression was significantly different among four groups. In multibacillary (MB) and paucibacillary (PB) groups, the level of RAGE expresson was significantly higher than that of that of atypical mycobacterial infections and sarcoidosis (p<0.01). In MB group, RAGE was expressed higher than in PB group (p<0.01). In MB group, RAGE expression of patients without lepra reaction was expressed higher than that of patients with lepra reaction (p<0.05), but in PB group, there was no difference in RAGE expression according to the lepra reaction. RAGE positivity was nearly undetectable in atypical mycobacterial infection and sarcoidosis groups. 2. EN-RAGE expression was significantly different among four groups. In MB, PB, and atypical mycobacterial infection, EN- RAGE was significantly higher than in sarcoidosis (p<0.01). There was no difference in EN-RAGE expression among MB, PB, and atypical mycobacterial infection groups. There was no difference in EN-RAGE expression according to the lepra reaction in PB or MB groups. 3. By double immunohistochemical stain, RAGE and EN-RAGE were coexpressed on the same cells of leprosy lesions, and both proteins were expressed on CD 68-positive macrophages. 4. Under the confocal laser scanning microscopic examination, both RAGE and EN-RAGE proteins were expressed in leproamtous leprosy, and their spatial colocalization along the cell surface provided the evidence suggesting their receptor-ligand interaction. 5. Soluble RAGE was not detected in the serum from both MB and PB groups. 6. EN-RAGE was detected in the serum from both MB and PB groups, and the level of EN-RAGE was similar between two groups. Patients with lepra reaction showed higher level of EN-RAGE than patients without lepra reaction in leprosy. Our data suggest that in leprosy, RAGE and EN-RAGE interaction might be involved in the proinflammatory process rather than in antimycobactierial activity, especially during lepra reaction. The blockade of the interaction RAGE and EN-RAGE, in the early step of inflammatory process, could be used therapeutically to minimize the inflammatory response and consequent tissue damage or sequale of leprosy.