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Time-resolved confocal fluorescence microscopy of dye-labelled DNA molecules

Time-resolved confocal fluorescence microscopy of dye-labelled DNA molecules
Issue Date
대학원 분자생명과학부
이화여자대학교 대학원
DNA는 결합된 분자들의 광물리, 광화학적 특성을 조절할 수 있는 독특한 환경을 제공하는 생분자이다. DNA와 작은 분자들간의 결합 및 상호 작용을 통해서 단백질이나 핵산 같은 중요 생분자와의 interaction에 관한 model system을 제공할 수 있고, DNA의 국부적 구조와 광화학적 특성을 이해하는데 많은 도움을 줄 수 있다. Part I 에서는 glyoxal을 이용하여 RGB 형광체를 DNA에 cross-linking하였다. Glyoxal은 ethidium을 DNA에 효과적으로 cross-link 할 수 있는 물질로 알려져 있고, 반응성이 강한 bifunctional aldehyde로서 DNA나 RNA등과 반응한다. 우리는 기존에 알려진 ethidium bromide외에도 DNA에 결합 가능한 형광체들을 선별하여 cross-linking을 시도하였다. Cascade blue는 blue DNA의 원료로, APTS와 acridine yellow green, proflavine은 green DNA로, ethidium bromide는 red DNA의 공급원으로 사용하였다. 라벨링이 완성된 DNA는 TCSPC system에 의해 형광 수명 시간을 측정하였다. 측정하여 얻은 형광 소멸 곡선은 SOE(sum of exponential) method로 fitting 하고 MEM(maximum entropy method)에 의해 형광 수명 분포 곡선을 얻는다. 그 결과 cascade blue와 APTS는 형광 수명 시간에 전혀 변화가 없었고, acridine yellow green과 proflavine은 DNA에 결합했을 때 형광 수명 시간이 약간 감소하였으며, ethidium bromide는 크게 증가하였다. Cascade blue와 APTS는 구조적 적합성으로, acridine yellow green과 proflavine은 guanine quenching에 의해, ethidium bromide는 proton transfer에 의해 형광 수명 시간에 변화가 생기는 것으로 보여진다. Ethidium bromide의 MEM 분석 결과 intercalation의 경우에는 bimodal로, cross-linking했을 때에는 trimodal로 분포 함수가 얻어져 cross-linking 상태가 intercalation보다 DNA의 구조 변화에 더 민감하게 반응하여 DNA의 국부적인 구조 변화를 더 잘 표현할 수 있다는 것을 알 수 있었다. Part II에서는 single DNA-EtBr의 형광 수명 시간을 측정하기 위한 단분자 형광 측정 장치를 구성하였다. 공초점 형광 현미경 장치를 이용하여 TCSPC 방법에 의해 single DNA decay data를 얻었고, Kohlrausch function(stretched exponential)으로 fitting하여 τ_(K), β, < τ > 값을 얻을 수 있었다. 그 결과 β 값은 0.6 근처에 가장 많은 분포를 보이고 τ_(K) 는 3∼4ns 사이에, 평균 형광 수명시간은 5∼6ns에 가장 많은 분포를 보였다. 이렇게 얻은 τ_(K) 와 β 를 대입, Cole-Davidson function을 이용하여 분포 함수 P(τ) 를 구할 수 있었다. 그 결과 분포함수가 넓어질수록 β값이 작아져 불균일성이 증가한다는 Kohlrausch function에 적합함을 확인했고 다양한 소멸곡선과 분포함수로 보아 single DNA의 불균일성에 대한 정보를 얻을 수 있었다.;DNA provides a unique organized environment for the control of photophysical and photochemical processes of DNA-bound guest molecules. Study on interactions of small molecules to DNA provides a model for protein-nucleic acid interactions and progress made in this field is useful in cancer research and in biotechnology. DNA-bound molecules can also be useful as probes to explore the molecular details of DNA local structure and to accelerate or to inhibit photochemical reactions. In part I, we studied spectroscopic characterization of fluorescence dyes cross-linked to ctDNA by glyoxal. Glyoxal is a highly reactive bifunctional aldehyde that is present in the environment and reacts with DNA and RNA. In the present studies, glyoxal was known to efficiently cross-link ethidium to DNA. In addition to ethidium bromide(red DNA), we found RGB source of DNA; cascade blue as blue DNA and APTS, acridine yellow green, and proflavine as green DNA. Time-resolved fluorescence spectroscopy has been used to probe the photophysical properties of various fluorophores cross-linked to ctDNA. Fluorescence decay profiles are obtained using the technique of time-correlated single photon counting(TCSPC), and subsequently analyzed using conventional sum-of-exponentials(SOE) routines and also the maximum entropy method(MEM). While cascade blue and APTS cross-linked to DNA did not show any change of lifetime compared with their free form in solution, acridine yellow green and proflavine had a small decrease in the fluorescence lifetime because of their structrral compatibility to DNA base pair and efficient quenching by guanine. In case of DNA-EtBr system, a large increase in the fluorescence intensity and fluorescence lifetime of ethidium bromide was observed. When EtBr binds to DNA, the proton transfer is inhibited due to the shielding from solvent molecules. The lifetime distribution of DNA-EtBr decays were analyzed using the MEM, intercalation decay demonstrates bimodal form and cross-linking decay shows trimodal form. In part II, we designed single molecule fluorescence spectroscopy measurements for single DNA-EtBr. Single molecule detection coupled with TCSPC offers a wealth of additional information not available from lifetime experiments of a bulk sample. Whereas a bulk lifetime measurements results in an ensemble averaged fluorescence decay time, the accumulation of hundreds of single molecule decays allows for the construction of a lifetime histogram of the molecule under consideration, therefore probing directly the heterogeneity present. Single DNA decay curve was acquired using confocal fluorescence microscopy combined with the TCSPC method. We fitted the decay curves for single DNA with Kohlrausch function, commonly known as stretched exponential and then we obtained the value of τ_(K), β, and < τ >. For the decay of single DNA-EtBr, we observed 0.28 < β < 0.741, 1 ns < τ_(K) < 7 ns. To get more quantitative measure of the decay behavior we applied Cole-Davidson function and we can explain the P(τ) of single DNA-EtBr. Single molecule studies of single DNA-EtBr dynamics in polymer confirm that heterogeneities give rise to the characteristically nonexponential dynamics in these systems.
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