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HeLa 세포에서 Estrogen이 TCTP와 Na,K-ATPase의 상호작용에 미치는 영향 연구

Title
HeLa 세포에서 Estrogen이 TCTP와 Na,K-ATPase의 상호작용에 미치는 영향 연구
Authors
이시내
Issue Date
2003
Department/Major
대학원 분자생명과학부
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
TCTP 또는 IgE-dependent histamine releasing factor는 히스타민 방출 활성을 가지고 있는 protein으로서 P21, P23, 등으로 불리기도 한다. TCTP/HRF는 tumor cell의 proliferative stage에 합성되는 특이적인 protein으로 생각되어왔으나 모든 종류의 정상적인 cell에서 발현될 뿐 아니라 human, rat, mouse 등의 여러 종에서 매우 높은 homology를 나타내는 것으로 보아 house keeping gene으로서 cell 내에서 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 본 실험실에서는 Yeast two-hybrid screening을 통해 TCTP/HRF가 Na,K-ATPase의 cytosolic domain 중 3rd loop에 결합한다는 사실을 밝혀낸 바 있고, TCTP/HRF가 Na, K-ATPase의 활성을 저해하는 역할을 한다고 예상한다. Na,K-ATPase은 α,β subunit으로 이루어진 heterodimer로, neural, cardiac, vascular smooth muscle등에서 Na^(+) 이온과 K^(+) ion의 transmembrane electrochemical gradient를 조절함으로써 심혈관계의 항상성을 유지하는 데 매우 중요한 역할을 하는 효소이다. 본 실험실에서 Na,K-ATPase의 α1 subunit의 3번째 loop을 bait로 하여 rat kidney cell library에서 yeast two-hybrid assay를 해보았을 때 positive clone의 상당수가 TCTP였다는 점에서, TCTP가 Na, K-ATPase와 상호작용을 하면서 신장에서의 Na ion의 움직임을 주관하는 등, 심혈관계의 항상성 조절에 관여하며 Na,K-ATPase의 inhibition으로 고혈압 등을 유발할 것이라는 가설을 세워볼 수 있다. Estrogen은 reproductive system에 중요한 역할을 하는 여성의 성호르몬이다. 그리고 estrogen 결핍시 심혈관계의 risk factor가 높아져 폐경기 여성에 있어서 허혈성 심질환, 고혈압, 고지혈증 등의 심혈관 질환의 가능성이 커진다고 알려져 있다. 또, estrogen은 심근막 세포에서 Na,K-ATPase에 직접적으로 작용하여 Na,K-ATPase를 활성화시키며, cell의 각종 oxidative stress를 줄여줌으로서 Na,K-ATPase가 저해되는 것을 막아준다. 본 논문에서는 TCTP/HRF가 Na,K-ATPase을 저해하는 현상을 실험적으로 확인하고, Na,K-ATPase를 activation하는 것으로 알려진 estrogen이 TCTP/HRF에 의해 Na,K-ATPase가 저해되는 것을 회복시켜주는지를 알아보았다. 또 이러한 estrogen의 역할이 TCTP의 세포내 발현 정도를 낮춰주거나 TCTP/HRF의 cell 내 localization을 변화시켜 cell membrane에 있는 Na,K-ATPase과 결합하여 저해하는 것을 막기 때문인지를 알아보는 실험을 진행하였다. 이러한 연구를 통해 TCTP/HRF가 Na,K-ATPase를 inhibition하며 estrogen이 이를 회복시켜줌을 확인했고, 이 estrogen의 회복 효과가 TCTP와 Na,K-ATPase에 대한 직접적인 작용이 아님을 보여줌으로써 다른 메커니즘의 존재를 예상하게 되었다. 또, TCTP/HRF가 2가지 form으로 나타나는 현상을 관찰하고 이것이 alternative splicing이나 alternative promoter와 같이 transcription 상에서 일어나는 일이 아님을 밝혀, post-translational event일 가능성이 더 높음을 알게 되었다. ;Translationally controlled tumor protein (TCTP) or IgE-depen dent histamine-releasing factor (HRF), also termed P21 in rat and P23 in human has a histamine releasing activity. TCTP/HRF had been thought to be synthesized in proliferative stage of tumor cell, but it was reported to be expressed in almost normal cell. TCTP/HRF is highly conserved among the species, suggesting that TCTP/HRF might function as a house keeping protein. In our laboratory, it was found that TCTP/HRF interacts with the third cytoplasmic domain of the αsubunit of Na,K-ATPase using yeast two-hybrid screening, and that TCTP/HRF inhibits Na,K-ATPase activity. Na,K-ATPase , a heterodimer , consists of α and β subunit and the enzyme plays a critical role in the maintenance of cardiovascular homeostasis by establishing transmembrane electrochemical gradients for sodium and potassium in neural, cardiac, vascular smooth muscle and renal tubular cells. In our laboratory, many positive clones were obtained and turned out to be TCTP when performing yeast two-hybrid screening using rat kidney cDNA library with the third cytoplasmic domain of Na,K-ATPase α1 subunit. It suggests that TCTP as a binding partner with Na, K-ATPase regulates the transport of sodium in kidney and participates in the homeostasis of cardiovascular system. Estrogen has an important role in female reproductive physiology and also present in many tissues of both sexes, including brain, bone, and the cardiovascular system. It has known that estrogen activates the sarcolemmal Na,K-ATPase, and blocks the inhibition of Na,K-ATPase by reducing the oxidative stress in cells. In this thesis, I showed that TCTP/HRF inhibits Na,K-ATPase and estrogen has a recovery effect to inhibitory function of TCTP/HRF. I performed the RT-PCR and western blotting, to show that estrogen doesn't reduce the expression level of TCTP in HeLa cell. I showed that estrogen doesn't influence the interaction of membrane Na,K-ATPase with TCTP/HRF by immunoprecipitation assay and membrane translocation assay. Also, I found that there are two forms of TCTP protein in HeLa and H9C2. The TCTP proteins are different from molecular weight about 2-3 kDa. I performed the RT-PCR and 5′-RACE assay and I detected only one band of TCTP. It indicates that altered TCTP molecular weight wasn't due to alternative splicing or alternative promoter. In conclusion, estrogen attenuates the inhibition of Na,K-ATPase by TCTP, and this recovery effect might occur via the down -regulation of oxidative stress.
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