쥐의 뇌조직 절편에서 zinc에 의한 nitric oxide 생성 변화 추적

Abstract

Colorless and gaseous molecule, nitric oxide (NO) is one of the most famous free radicals, which can diffuse easily and fast through cell membrane broadly, and exerts many functions in the physiological and pathological conditions through all brain regions. In the case of zinc (Zn^(2+)), almost 90 percents of Zn^(2+), a divalent cation, exists as a cofactor or co-enzyme of proteins important in living bodies, whereas less than 10 percents of Zn^(2+) act as neuro-modulator in free ion state either in synaptic vesicles or cytosol. Both NO and Zn^(2+) play important roles in mammalian brains, and their possible relations have also been recently studied. For instances, NO injected into the rat brain induces the accumulation of chelatable Zn^(2+) (Cuajungco et al, 1998, Fredrickson et al, 2002), and Zn^(2+) deficiency increases the number of NADPH-diaphorase positive neurons in the rat (Itsugi et al., 1998). Zn^(2+) can destabilize NOS by binding to NOS in the form of ZnS4 (Li, 1999, Hemmens et al, 2000), and NO increases the Zn^(2+) by disturbing the bond of Zn^(2+)-metallothionein through nitrosylation of thiol group of metallothionein (Denise et al., 1997, Charuvila et al., 1999, St Croix, 2002, Charubila et al., 1999). In this study, the hypothesis for the possible mechanisms of interrelation between NO and Zn^(2+) was framed as follows; NO which is generated by calcium ions through NMDA receptor in postsynaptic cell increases the release of Zn^(2+) from presynaptic terminals by changing the synaptic plasticity (Schuman and Madison, 1991; Hawkins et al., 1998) or by breaking the bond of Zn^(2+) and metallothionein (Penkowa et al, 1999, Pearce et al, 2000, Katakai et al, 2001); The released Zn^(2+) depresses NO production through NMDA activity. I investigated any possible interrelation of Zn^(2+) to NO using imaging methods as an initial step to examine the hypothetical negative feedback mechanism of NO suggested above. In the hippocampal complex, using Timm's modified method and NADPH-diaphorase staining, I could observe the distribution of Zn^(2+) and NOS, which was comparable to the previous findings (Hope et al., 1989 and 1991; Vaid et al., 1996). It was also confirmed that these two substances were close enough to affect their roles each other. The fluorescence of TSQ (Zn^(2+) chelator) was more significantly decreased in brain slices treated with NO donor (SNP; sodium nitroprusside) and Ca-EDTA (membrane non permeable Zn^(2+) chelator) than those treated with Ca-EDTA alone. It indicates that Zn^(2+) was released out of the neurons by NO. Pre-treatment of Zn^(2+) dramatically decreased the fluorescence of DAF-2DA, a detector of NO production, showing that the production of NO was decreased by Zn^(2+). All these results strongly suggest that NO may control its own intracellular production by affecting the Zn^(2+) release in a negative feedback mode.;무색 기체인 nitric oxide (NO)는 뇌의 각 영역에서 일어나는 생리학적 현상에 다양하게 관여하는 대표적인 생체 free radical의 하나이다. 한편, +2가의 양이온인 zinc (Zn^(2+))는 대부분이 단백질에 결합하는 조효소나 구성성분으로 존재하며, 약 10% 정도가 시냅스 소포 내 또는 자유 이온 상태에서 neuro-modulator로서 작용하고 있다. NO와 (Zn^(2+))는 각기 독자적으로 생체 내에서 중요한 역할을 수행하고 있으며, 둘 간의 직접 또는 간접적인 상호 연관성이 주로 병리학적 조건과 관련되어 활발히 연구되어 왔다. 예를 들면 신경 퇴행성 질병과 관련, NO 증여자를 쥐 뇌에 주입하고 Zn^(2+)의 변화를 조사한 결과 NO가 chelation 가능한 Zn^(2+)의 축적을 유도하였으며 (Cuajungco et al, 1998, Fredrickson et al, 2002), Zn^(2+) 섭취가 결핍된 쥐에서는 NADPH diaphorase에 활성을 보이는 신경 세포들이 증가하였다 (Itsugi et al., 1998). 본 연구에서는 생리학적 조건에서 Zn^(2+)와 NO의 상관 관계를 토대로 이들의 상호 작용 메커니즘에 대해서 다음과 같은 가설을 세웠다. Glutamate를 방출하는 뉴런에 자극이 주어지면서 방출되는 glutamate는 NMDA 수용체를 통해 세포 내 Ca^(2+) 이온을 증가시키며, 증가된 세포 내 Ca^(2+) 이온은 NOS를 활성화 시켜 NO를 생성할 것이다. NO는 세포 밖으로 확산되면서 시냅스 소포 내의 Zn^(2+)를 방출시키거나 (Schuman and Madison, 1991; Hawkins et al., 1998) Zn^(2+)와 metallothionin의 결합을 해지하여 자유 이온 상태의 Zn^(2+) 농도를 증가시킬 것이다 (Penkowa et al, 1999, Pearce et al, 2000, Katakai et al, 2001). 이렇게 증가된 Zn^(2+)는 시냅스 후 영역으로 이동, NMDA 수용체에 결합, 수용체의 활성을 억제 시키리라 예상할 수 있다. NMDA 수용체의 억제는 Ca^(2+) 이온의 유입을 억제할 것이고, 따라서 NOS의 활성을 억제, NO 생성을 감소시킬 것이다. 위의 가설을 증명하기 위한 기초 작업으로 조직학적 방법을 동원하여 1) NO와 Zn^(2+) 두 물질의 분포를 확인하였고, 2) in vitro 뇌 조직에서 NO와 Zn^(2+)의 상호연관성의 변화 여부를 추적하였다. Zn^(2+)의 분포는 Timm’s modified method를 (Hope et al., 1989 and 1991), NO의 생성 여부는 NADPH diaphorase 활성을 이용하였다 (Hope et al., 1991; Vaid et al., 1996). Zn^(2+)는 아몬각 CA 영역의 SO, SL과 DG 영역의 ML, 그리고 MF 영역에, NOS는 CA 영역의 PC와 MF 영역에서 매우 풍부하게 존재하고 있음을 알 수 있었는데, 이 두 물질이 자극에 의해 상호간에 영향을 미칠 수 있을 만큼 충분히 밀접해 있음을 확인하였다. Zn^(2+)와 결합하여 형광을 내는 TSQ와 Zn^(2+) chelator인 Ca-EDTA를 이용해서, NO donor 투여 시 소포체 Zn^(2+)의 방출 여부를 조사하였고, 또한 NO 생성을 측정할 수 있는 DAF-2DA를 이용해서 Zn^(2+) 처리에 따른 NO 변화를 추적하였다. NO 증여자, 5 mM SNP에 의해서 세포 내 Zn^(2+)가 세포 밖으로 방출됨을 확인할 수 있었고, 300 μM Zn^(2+)에 의해 NO 생성이 현저히 감소하였다. 이러한 일련의 실험을 통해, 본 논문에서는 제시된 가설에서와 같이 생성된 NO가 시냅스 전 영역에 존재하는 Zn^(2+) 방출을 유도, NMDA 수용체를 억제함으로써 (Wesbrook and Mayer, 1987) 음의 피드백 메카니즘을 갖고 있음을 제안하고자 한다.