Direct association of the Adaptor Protein Src homology 2 Domain-containing Leukocyte Phosphoprotein of 76 kDa (SLP-76) with the p85 Subunit of the Phosphoinositide 3-Kinase as a new role in T cell activation

Abstract

The importance of an adaptor protein, Src homology 2 (SH2) domain-containing leukocyte protein of 76 kDa (SLP-76) in T cell development and function has been well-characterized using cells and animals that are deficient in this protein. SLP-76 contains an amino-terminal region with tyrosine phosphorylation sites, a central proline-rich region, and a carboxyl-terminal SH2 domain. To play proper roles as an adaptor protein in T cells, each domain of SLP-76 is expected to interact with particular molecules after the ligation of T cell receptor. In search of molecules that interact with each domain of SLP-76 in an activation-dependent manner, a Jurkat T cell library was screened by yeast two-hybrid methods using kinase-fused bait proteins of SLP-76. p85, a subunit of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) was identified as one of molecules that interact with the amino-terminal region of SLP-76. The results indicate that SLP-76 association is mediated through one of the SH2 domains of p85 (N-SH2) using the various mutants of each protein. Unlike the SLP-76 association with Vav, Nck, or Itk, the data show that tyrosine phosphorylation either at 113 or 128 is sufficient for the association with the N-SH2 of p85. The data also show that the SLP-76 association with p85 participates in the activation of PI3K signaling pathways. The present study demonstrated a correlation of the p85-SLP-76 association and downstream Akt activation. These data, collectively, suggest a new role of SLP-76 adaptor protein in the signaling cascade of Akt activation by a direct association with the p85 subunit of PI3K.;T 임파구의 발달과 기능에 있어서 Src homology 2 (SH2) domain-containing leukocyte protein of 76 kDa (SLP-76) 단백질의 중요성은 이 단백질이 결여된 T 세포와 마우스를 사용함으로서 잘 알려져 있다. SLP-76는 tyrosine 인산화 잔기를 가지는 아미노기 말단부분과 중간에 있는 proline이 풍부한 부분, 그리고 카르복실기 말단에 있는 SH2 영역을 가지고 있다. 따라서, T 세포 수용체의 자극후 SLP-76의 각 영역은 특정 단백질들과 상호결합하여 T 세포의 신호전달에 있어서 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 인산화 된 SLP-76의 아미노기 말단 영역과 상호결합하는 T 세포 초기신호전달에 관여하는 분자들을 찾기위해, SLP-76 아미노기 말단 영역에 키나아제(kinase) 영역을 융합시킨 미끼 단백질을 사용하여 yeast two-hybrid 방법에 의해 Jurkat T 세포 library를 검색하였다. 그 결과, SLP-76의 인산화된 아미노기 말단부분과 상호결합하는 분자들 중 하나로 phosphoinositide 3-kinase (PI3K)의 subunit인 p85를 확인하였으며, 각 단백질의 다양한 변종을 사용하여 분석한 결과, SLP-76와의 상호결합이 p85의 SH2 영역 중 하나인 아미노기 부분의 SH2 (N-SH2)를 통해 이루어짐을 밝혔다. 또한, T 세포가 활성화 될 때 SLP-76의 113번과 128번 위치의 tyrosine 잔기들의 인산화를 필요로 하는 Vav 또는 Nck 분자의 SH2영역과 SLP-76의 상호결합에서와는 달리 SLP-76와 p85의 N-SH2의 상호결합을 위해서는 tyrosine 113 또는 tyrosine 128 중 하나의 tyrosine 인산화만이 충분함을 밝혔다. 이러한 p85-SLP-76의 상호결합과 PI3K 신호전달과정에서의 Akt 활성이 상호연관성이 있음을 증명함으로써, SLP-76와 p85의 상호결합이 PI3K 활성화 경로의 신호전달에 참여하고 있음을 보여주었다. 종합적으로 본 연구의 결과들은 PI3K의 p85 subunit과의 직접적인 결합을 통하여 Akt 활성화를 유도하는 신호체계에 있어서 SLP-76 단백질의 새로운 역할을 제안한다.