Studies on conformation switching of β-amyloid peptides in the course of aggregation by fluorescence resonance energy transfer(FRET)

Abstract

뇌 속의 베타 아밀로이드 펩타이드의 침착은 알츠하이머 질환의 주요 병인으로 알려져 있다. 베타 아밀로이드 펩타이드는 대개 39-43개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 정상적인 세포 대사과정을 통해 아밀로이드 선구 단백질로부터 생성된다. 이러한 베타 아밀로이드 펩타이드가 응집체를 형성하게 되면 세포 독성을 나타내게 되는데, 응집 과정에 대해서는 아직 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 다양한 조건 하에서 응집 과정 중 베타 아밀로이드 펩타이드의 형상 변화를 형광 공명 에너지 전달 현상을 이용하여 관찰하였다. 본 연구에서는 베타 아밀로이드 펩타이드(11-25)를 모델계로 사용하였는데, 이는 중 응집체 형성에 중요한 모티프인 KLVFF를 중심부에 포함하고 있다. 아민에 반응성이 있는 TMR 분자와, 티올 반응성이 있는 DABMI 분자를 각각 에너지 주개와 받개로 하여 FRET 아밀로이드(11-25)를 구성하였다. 펩타이드의 양단간의 거리는 형광 수명으로부터 계산 가능하였다. 본 실험은 생체 내 pH와 동일한 pH 7.4와 lysosome 내부의 pH에 해당하는 pH 5.0에서 각각 수행하였다. 펩타이드의 양단간의 거리가 응집 과정이 진행되면서 크게 변화하였는데, 이는 가해준 펩타이드의 농도와 상관관계를 보였다. 이러한 결과는 결국 아밀로이드 펩타이드가 자체 응집되는 과정에서 무작위적인 코일 형태(단량체), 뭉쳐진 코일 형태(다량체), 미셸구조, 펼쳐진 베타 쉬트 구조(피브릴) 등의 형상 변화를 거치게 된다는 사실을 의미한다. 우리는 처음으로 베타 아밀로이드 펩타이드(11-25)에 대해서 pH 5.0에서는 3 μM, pH 7.4에서는 70 μM의 critical micelle concentration(CMC)을 가짐을 관찰하였다. 뿐만 아니라, 미셸구조를 갖는 아밀로이드 펩타이드는 뭉쳐진 코일이나 피브릴 구조를 갖는 펩타이드보다 짧은 양단간의 거리를 갖는다는 것을 확인하였다. 또한 우리는 Maximum enetropy method를 도입하여 FRET 아밀로이드의 형광 수명 분포에 대한 정보도 획득하였다. 다음으로, 동일한 아밀로이드 베타 펩타이드의 형상 변화 연구를 Zn^2+ 이온 존재 하에서 수행하였다. 응집 형성 과정은 Zn^2+ 이온이 존재하지 않는 경우와 동일한 경향을 나타냈으며, pH 7.4에서만 더 낮은 critical micelle concentration이 관찰되었다. 이것은 결국 Zn^2+ 이온이 pH 7.4에서는 His의 N(t) 과 결합함으로써 응집 형성 과정을 촉진함을 의미한다. 또한 베타 아밀로이드 펩타이드(1-40)의 형상 변화를 FRET 아밀로이드(11-25)를 이용하여 관찰하였다. 이 경우에는 베타 아밀로이드 펩타이드 (11-25)와는 다른 양단간의 거리 변화를 보였으며, critical micelle concentration은 관찰할 수 없었다. 하지만, 이 경우에도 높은 농도에서는 11-25의 아미노산들이 완전히 펼쳐진 베타-sheet구조를 갖게 됨을 확인하였다. 마지막으로, N-말단에 트립토판이 라벨링된 아밀로이드 펩타이드(11-25)의 트립토판 형광으로부터 얻은 결과와 FRET 아밀로이드(11-25)로부터 얻은 결과를 비교 연구하였다. 이로부터, pH 7.4인 용액에서 트립토판이 라벨링된 아밀로이드 펩타이드(11-25)가 20 μM에서는 다량체로 존재하고, 220 μM에서는 피브릴 구조로 존재함을 확인하였다. 하지만, pH 5.0에서는 두 농도에서 모두 피브릴 구조 존재함을 확인하였다. 그러므로, pH 7.4에서는 농도변화에 따라 형광 수명이 크게 변화한 것이며, pH 5.0에서는 거의 변화가 없었던 것이다. 그리고, pH 5.0에서의 트립토판의 형광 수명이 pH 7.4에서보다 짧은 것은 양성자화된 히스티딘에 의한 소광 때문임을 확인하였다.;β-amyloid peptides deposition in the brain has been known to be the major pathogenesis of Alzheimer’s disease. Aβ monomers, consisting of 39-43 amino acid residues, are produced from amyloid precursor protein by a normal cell metabolism. Aβ peptide self-assembles into aggregates, which are highly toxic to cells. But the aggregation pathway of this peptide has not been understood systematically at the molecular level. In this study, we first report that amyloid beta peptide undergoes multi-step conformational changes in the course of aggregation. We use the Aβ fragment, Aβ(11-25), as a model system because it contains the aggregation key motif, KLVFF(16-20), in the central region. An amine reactive TMR (tetramethylrhodamine) as the donor and a thiol-reactive acceptor, DABMI (4-dimethylaminophenylazophenyl-4’-maleimide) were covalently coupled to the peptides. The end-to-end distance of the peptide was determined by applying fluorescence resonance energy transfer (FRET). We carried out the experiments at physiologically equivalent pH 7.4 and at pH 5.0. We observed a dramatic change in the end-to-end distance in the course of aggregation, which correlated with the peptide incubation concentration. These results suggest that the amyloid peptides undergo multi-step conformational changes during self-assembling such as random coil (monomers), collapsed coil (multimers), micellar structure, and extended β?sheet in fibrils. We first identified the critical micelle concentrations of Aβ(11-25) which occur at ca. 3 μM for pH 5.0 and ca. 70 μM for pH 7.4. Our experimental results clearly show that the end-to-end distance of Aβ(11-25) in micelle-like structure becomes much shorter than that in the collapsed coil or fibril structure. We also obtain the fluorescence lifetime distribution of FRET amyloid peptide from the measured bulk decay curves at various concentrations by employing the Maximum Entropy Method (MEM). We also monitored the aggregation mechanism in the presence of Zn^2+ ions. In the presence of Zn^2+ ions, the aggregation pathway has the same tendency to that in the absence of Zn^2+ ions. However, critical micelle concentration occurs at much lower concentration compared to that in the absence of Zn^2+ ions only at pH 7.4. These results mean that Zn^2+ ions promote the aggregation and conformation switching of Aβ(11-25) at pH 7.4 through the cross-linking between Zn^2+ ions and histidine residues. We also monitored the conformational changes of Aβ(1-40) using FRET Aβ(11-25) as a probe molecule. The end-to-end distance change was different from that of Aβ(11-25). Critical micelle concentration was not confirmed from our experimental results but dramatic distance changes were monitored over ca. 60 μM. Our experimental results suggest that the sequence 11-25 has fully extended structure in full sequence Aβ, Aβ(1-40). Finally, we also compared the results obtained from studies on Trp-Aβ(11-25) with those obtained for FRET amyloid. We confirmed that Trp-Aβ(11-25) exists as multimers at 20 μM but as fibrils at 220 μM in neutral buffer solution. However, it has the same fibril structure at both concentrations in acidic condition. Therefore, the fluorescence lifetime of tryptophan was dramatically increased at pH 7.4 but was maintained as almost the same value at pH 5.0 with increasing the peptide concentration. The fluorescence quenching of Trp-Aβ(11-25) at pH 5.0 was originated from protonated histidine residues.