Involvement of PLA₂-related pathway in muscarinic receptor-mediated sAPPα release and capacitative calcium entry

Abstract

Chronic inflammatory processes are associated with pathology of Alzheimer's disease (AD). The expression of both cyclooxygenase-2 (COX-2) and phospholipase A_(2) (PLA_(2)) appears to be strongly activated during AD, indicating the importance of inflammatory gene pathways as a response to brain injury. The amyloid precursor protein (APP) is a transmembrane protein that produces βA4 amyloid peptide, found in the brains of AD, by proteolytic cleavage. APP normally undergoes proteolytic cleavage within the Ab sequence by an unidentified enzyme designated a-secretase, liberating a soluble N-terminal fragment (sAPPα). Biological activities of sAPPα have been shown to include promotion of neuronal cell survival, adhesive interactions, neurite outgrowth, synaptogenesis, and synaptic plasticity. Previous studies reported that muscarinic (M1 and M3) receptor activation increase sAPPα release. However, the signaling mechanism for the regulation of sAPPα release mediated by muscarinic receptor activation is not clearly understood. The purpose of this study is the investigation of the signaling mechanism for the regulation of sAPPα release mediated by muscarinic receptor activation. Especially, the involvement of PLA_(2)-related pathways in muscarinic receptor-mediated sAPPα release and capacitative Ca^(2+) entry (CCE) is examined in human neuronal cell line, SH-SY5Y, which endogenously expresses both M3 and M1 muscarinic receptor subtypes and APP. First, we investigated that the relationship between PLA_(2)-related pathway and muscarinic recptor-mediated sAPPα release. Treatment of cells with a non-selective PLA_(2) inhibitor, manoalide, blocked the secretion of both basal and oxoM-stimulated sAPPα, whereas activated by a PLA_(2) activator, mellittin. In addition, PLA_(2) metabolites, the arachidonic acid (AA) and prostaglandin E_(2) (PGE_(2)), strongly increased the secretion of both basal and oxoM-mediated sAPPα. These results implicate that PLA_(2)-related pathway regulates basal sAPP processing and secretion and is involved in muscarinic receptor-mediated sAPPα release in this cells. Next, to investigate whether the down streams of PLA_(2) pathways, COX and lipoxygenase (LOX) pathways, regulate the muscarinic-mediated sAPPα release, we examined the effects of COX and LOX inhibitors on sAPPα release. The COX and LOX inhibitors partially increased constitutive sAPPα release, but failed to show significant change in oxoM-stimulated sAPPα release. In additon, muscarinic receptor activation induced no significant change of basal PGE_(2) level, but inhibited AA-stimulated PGE_(2) production. These results suggest that in muscarinic receptor activation, AA less occur COX pathway and AA-stimulated sAPPα release was more affected by AA itself, than its COX metabolites such as PGE_(2). Although COX and LOX are maybe involved in constitutive release of sAPPα, our results indicated that muscarinic receptor mediated sAPPα release is regulated by the generation of AA through PLA_(2) activation rather than COX and LOX activities. Secondly, we tried to investigate whether the PLA_(2) isoforms differently regulate the muscarinic receptor-mediated sAPPα release, and examined the relationships between activation of PLA_(2) isoforms and CCE mediated by muscarinic receptors in SH-SY5Y cells. Treatment of the three isoform-selective PLA_(2) inhibitors, [thioether amide-PC (TEA-PC; an inhibitor of secretary PLA_(2), sPLA_(2)), haloenol lactone suicide substrate (Helss or BEL; an inhibitor of calcium independent PLA_(2), iPLA_(2)), arachidonyl trifluoromethyl ketone (AACOCF_(3); an inhibitor of calcium dependent PLA_(2), cPLA_(2))], all reduced muscarinic receptor-mediated sAPPα release, suggesting that all of the three PLA_(2) isoforms might be involved in muscarinic receptor-mediated sAPPα release. OxoM-induced calcium entry was reduced by pretreatment of manoalide, TEA-PC and BEL, but not AACOCF_(3). In addition, we observed that pretreatment of SKF96365 and Gd^(3+) (inhibitors of CCE) inhibited oxoM-induced cPLA_(2) activation but showed no significant effect on iPLA_(2) activation induced by oxoM. These results indicate that although both iPLA_(2) and sPLA_(2) isoforms do not regulated by CCE, they participate in the muscarinic receptor-mediated activation of CCE, and then the CCE induced by PLA_(2) isoform activation is involved in muscarinic receptor-mediated increase in sAPPα release. On the other hand, CCE activation induced by muscarinic receptor activation could regulate muscarinic receptor-mediated cPLA_(2) followed by sAPPα release. This study on the mechanisms explaining the muscarinic receptor-mediated sAPPα release may lead to a better understanding of the significance of the cholinergic system in the pathophysiology of AD.;아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursor protein: APP)은 내재성 막 당 단백질 (integral membrane glycoprotein)로서, 대사과정 중 아밀로이드 펩티드 (amyloid-β peptide : Aβ)를 생성한다. 아밀로이드 펩티드는 기억력 저하, 인지능력 저하, 주의력 저하, 사고력 저하와 판단력 저하 등의 임상적 증상과, 대뇌피질과 해마 또는 편도핵에서 neurofibrillary tangle과 senile plaque이 관찰되어지는 병리학적 증상을 나타내는 신경퇴행성 질환의 일종인 Alzheimer disease (AD)에 있어서, 학습과 기억 능력에 손상을 주는 요인으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 이에 반해, 정상적인 세포에서 APP의 대사 과정 중에 생성되는 용해성 아밀로이드 전구단백질 (soluble amyloid precursor protein : sAPP)는 세포 밖으로 분비되어 세포의 생존, 증식과 부착을 조절하면 신경돌기의 발아 후 생육을 유도한다. APP의 분해과정에 대한 많은 연구가 행하여져 왔고, 그 과정에 무스카린성 아세틸콜린 수용체가 관계한다는 사실이 보고되었으나, 무스카린성 아세틸콜린에 의한 sAPP의 정확한 유리조절기전에 대해서는 아직 자세히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 subtype중 M3가 다량 발현된 신경세포인 SH-SY5Y neuroblastoma cells를 이용하여 세포 배양액으로부터 유리된 sAPPα를 측정하였다. 유리된 sAPP의 양을 측정하기 위한 방법으로, amyloid beta의 1-17 amino acid residues를 인식하는 monoclonal antibody를 사용하여 Western blotting을 시행하였고, ImageGauge 프로그램을 이용하여 정량하였다. sAPPα는 정상적인 세포의 대사과정 중 세포배양액으로 유리되고, 무스카린성 효능제인 oxoM에 의해서 그 유리가 증가하였다. 본 연구에서는 특별히 염증반응과 무스카린 성 수용체에 의한 sAPPα 유리에 대해 초점을 맞췄다. 이 결과, 무스카린성 효능제에 의한 sAPPα 증가과정은 PLA_(2)의 활성에 의해 조절되었다. PLA_(2)의 활성제로 알려진 melittin이 sAPPα 유리를 증가시켰으며, 이런 효과는 PLA_(2)의 저해제인 manoalide에 의해 감소되었다. 또한 염증 반응 중간 산물인 arachidonic acid 와 염증 매개 물질인 PGE_(2)가 무스카린성 효능제에 의한 sAPPα 유리를 증가시키는 것으로 나타났고, 이런 결과들은 염증반응이 무스카린성 효능제에 의한 sAPPα 유리에 중요하게 작용함을 말해준다. 그러나 COX와 LOX 저해제들을 전 처리했을 때 oxoM에 의한 sAPPα 유리량에 변화를 일으키지 않고 basal sAPPα 유리량만 변화시키는 것을 보아, 이 효소들은 무스카린 성 수용체에 의한 sAPPα 유리에 크게 관여하지 않는 것으로 사료된다. 더욱이 무스카린성 수용체가 활성화 될 경우 arachidonic acid의 COX로 가는 반응이 저해되어 PGE_(2) 생성이 줄어든 것을 볼 수 있어, COX나 LOX의 활성보다는, PLA_(2) 활성에 의해 생성되는 arachidonic acid가 무스카린성 수용체에 의한 sAPPα 유리에 중요하게 관여함을 알 수 있었다. 이전 연구에서 우리는 무스카린성 효능제에 의한 sAPPα 유리가 capacitative calcium entry (CCE)가 중요한 역할을 하는 것을 알았다. 이러한 결과는 CCE 억제제에 직접 또는 간접적으로 작용하는 억제제들인, Gd^(3+) 혹은 SKF96365를 전처리 했을 때, oxoM에 의한 외부 Ca^(2+) 유입이 차단되고, 이와 동일실험조건에서 oxoM에 의한 sAPPα 유리증가에 대한 유의적인 억제가 나타남으로써 확인되었다. CCE는 무스카린성 수용체 활성에 의해 유도되는 세포 내 Ca^(2+) 저장소의 고갈을 보충하기 위한 것으로, 실험 결과, 무스카린성 수용체 활성화에 의한 sAPPα 유리 증가기전에 중요한 역할을 하는 것을 알아냈다. 다음으로 우리는 무스카린성 수용체 활성화에 의한 CCE 유리 증가기전에 어떤 PLA2 isoform가 관여되는지를 알아보기 위하여, 각 isoform의 억제제를 사용하여 oxoM에 의한 Ca2+ 변화를 관찰하였다. 그 결과 cPLA_(2)의 저해제 (AACOCF_(3))를 제외한, iPLA_(2) (BEL)와 sPLA_(2) (TEA-PC)의 저해제들이 무스카린성 수용체 활성화에 의한 CCE에 대해 농도 의존적으로 유의적인 억제를 나타내었다. OxoM에 의한 sAPPα 유리증가가 c, i, sPLA_(2) 모두의 저해제에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것으로 보아, PLA_(2) isoform에 따라 다른 방법으로 무스카린성 효능제에 의한 sAPPα 유리를 조절하는 것으로 추론된다. 이와 반대로, oxoM에 의해 유도된 CCE가 세포내의 PLA_(2) 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, PLA2 assay kit을 이용하여 세포내의 cPLA_(2)와 iPLA_(2) 의 활성을 측정하였다. 그 결과 무스카린성 수용체 활성에 의해 cPLA_(2)와 iPLA_(2) 의 활성이 모두 증가하였으며, CCE의 억제제들 (Gd^(3+), SKF96365)에 의해 무스카린 수용체 의한 cPLA_(2)의 활성이 현저하게 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 이는 무스카린성 수용체 활성화에 의한 CCE 유리에 iPLA_(2)와 sPLA_(2)가 관여하며, 이렇게 유리된 CCE는 다시 cPLA_(2)의 활성에 관여하는 것을 알려준다. 즉, iPLA_(2)와 sPLA_(2)에 의한 무스카린성 효능제에 의한 sAPPα 유리에는 CCE가, CCE에 의한 sAPPα 유리에는 cPLA_(2)가 관여되는 것으로 추론된다. 이러한 실험결과를 바탕으로, 무스카린성 수용체 활성화에 의한 sAPPα 유리증가기전을 밝힘으로써 AD의 병리 기전을 더 명확히 이해하고, 신경보호작용이 있는 것으로 밝혀진 sAPPα의 유리를 조절시킴으로 AD의 치료제 개발에 새로운 지표를 제시할 수 있을 것이라고 사료된다.