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유방암 세포에서 CYP1B1 및 pERE-Luc 유전자 조절 기전 연구

Title
유방암 세포에서 CYP1B1 및 pERE-Luc 유전자 조절 기전 연구
Authors
조민정
Issue Date
2003
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
히스톤 탈아세틸화 효소는 핵 내 단백질인 히스톤을 탈아세틸화 시켜 유전자 전사 억제 작용에 관여한다. 이중 히스톤 탈아세틸화 효소 단백질들은 p53, GATA-I, TFⅡE, TFⅡF, ER 등을 탈아세틸화 시킴으로써 특정 표적 유전자의 발현을 억제한다는 것이 알려졌으며(Juan LJ. et al. 2000; Boyes J. et al. 1998; Imhof A. et al. 1997), Rb 단백질과 결합하여 E2F 전사 단백질의 활성을 억제함으로써 세포의 암화(oncogenesis) 작용을 정지시키는 것으로 알려졌다(Vigushin DM. et al. 2001; Wang C. et al. 2001; Brehm A. et al. 1998; Magnaghi-Jaulin L. et al. 1998; Sears R. et al. 1997). 따라서 히스톤 탈아세틸화 효소 억제 작용을 통하여 암 억제 유전자 발현을 유도함으로써 암을 치료 할 수 있을 것으로 기대된다. 그러므로, 현재까지 여러 가지 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제가 암 치료 및 예방의 목적으로 개발되었다. 본 실험에서는 기존에 널리 알려진 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제인 Trichostatin A, HC-toxin과 새롭게 합성되어진 IN2001과 IN2002가 사람 유방암 세포인 MCF-7에서 ERE의 유전자 전사 조절에 어떠한 영향을 미치는 지 알아보기 위하여 ERE-Luc 유전자가 영구히 포함된 MCF-7-ERE세포와 일시적으로 transfection 시켜준 세포에서 발현된는 luciferase 활성을 측정하였다. 또한 이들 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제가 MCF-7에서 세포주기에 어떠한 영향을 미치는 지를 알아보기 위하여 Flow Cytometer Analysis(FACs)를 통한 실험을 행하였고, DAPI staining을 통하여 apoptosis의 여부를 알아보았다. 실험에서 사용한 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 모두 transient transfection의 경우와 stable cell 모두에서 luciferase 활성을 대조군에 비하여 농도 의존적으로 증가 시켰다. 10^(-10) M의 17β-estradiol과 비교하면, transient하게 ERE-Luc 유전자를 세포에 넣어준 경우는 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 단독으로 넣어주었을 때 Estradiol(E2)에 의한 luciferase 활성보다 더 크게 나타났고, E2을 병용처치 하여도 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 단독으로 처치한 경우와 큰 차이를 보이지 않았다. MCF-7-ERE 세포에서는 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 단독으로 넣어주었을 경우, E2 10^(-10) M을 처치한 경우보다 적은 luciferase 활성을 나타내었고, E2와 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 같이 넣었을 때는 E2 단독 처치 시보다는 적고 억제제만의 반응보다는 큰 luciferase 활성을 보였다. MCF-7-ERE에서 IN2001과 IN2002가 증가시키는 luciferase 발현은 tamoxifen에 의하여 저해되었다. FACs를 사용하여 세포주기의 변화를 알아보았을 때 사용한 모든 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제가 G_(2)/M phase를 증가시키는 것을 알 수 있었다. 이러한 반응은 12시간동안 처치하였을 때에도 뚜렷하게 관찰되었고, 24 시간에서도 비슷한 경향을 보였다. 48시간에서는 G_(2)/M phase로의 이동하는 경향과 더불어 뚜렷한 apoptosis가 일어나는 것이 관찰되었다. CYP1B1 유전자는 주로 2,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), 3-methychloroanthracene (3MC)과 같은 다환상 방향족 탄화수소에 의하여 유도된다. 이러한 유도 작용은 여러 가지 화합물에 의해 조절받는다. 본 실험에서는 사람의 CYP1B1의 5' flanking DNA를 luciferase reportor 유전자를 포함한 vector에 클로닝하여(phCYP1B1-Luc) MCF-7 세포에 transfection하고 여러 가지 화합물을 처리하여 발현되는 luciferase 활성을 측정하였다. TCDD에 의해 유도 발현된 luciferase 활성을 CYP1B1 효소의 선택적 저해제로 알려진 2, 4, 3, 5'-tetramethoxystilbene(TMS)가 농도 의존적으로 저해하였고, 3MC에 의해서 발현된 luciferase 활성은 TMS가 저해하지 못하였다. TCDD와 3MC는 다른 기전을 통하여 CYP1B1을 유도하는 것으로 보인다. TCDD에 의해 유도 발현된 luciferase 활성은 저산소 상태 유도물질인 CoCl2의 전처치에 의해 CYP1A1과 마찬가지로 농도 의존적으로 저해되었다. 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제인 Trichostatin A, HC-toxin, IN2001, IN2002는 농도 의존적으로 MCF-7세포에서 luciferase 활성을 증가 시켰고, 이 물질들은 TCDD와의 병용처치에 의해서 TCDD 단독 처치시 보다 luciferase 활성을 더욱 크게 증가시켰다. Polyaromatic hydrocarbone (PAH)중에서 CYP1A1 유전자의 전사를 크게 증가시키는 것으로 나타났던 Benzo(k)fluoroanthene과 Dibenzo(a,h)anthracene이 CYP1B1 유전자에는 어떠한 작용을 하는지를 알아보았다. 두 물질 모두에서 농도 의존적으로 luciferase 활성이 증가하였다. E2는 TCDD에 의해 유도 발현된 luciferase 활성을 저농도에서는 증가시키고 고농도(10^(-6) M)에서는 저해하는 경향을 보인다. 반면 Diethylstilbestrol (DES)의 경우는 별다른 영향을 보이지 않았다. DES의 경우는 E2와는 달리 에스트로겐 활성을 보이기는 하지만, CYP1B1에 의하여 대사 받지 않는 합성 물질이다. E2와 DES의 이러한 차이가 CYP1B1 유전자의 발현 조절에 차이를 나타내는 원인이 될 수 있다. ;In this study, we tried to understand the mechanism of of CYP1B1 gene expression MCF-7 cells. Acetylation and deacetylase of histone are important for gene expression. We observed the effect of HDACs inhibitors on estrogene response element (ERE) in MCF-7 cells were transfected with pERE-Luc transiently and MCF-7-ERE stable cells. HDACs inhibitors alone showed smaller effect on luciferase activity in MCF-7-ERE than MCF-7 transfected with pERE-Luc transiently. Estradiol (E2) had additional stimulatory effects on HDACs inhibitors induced luciferase activity in MCF-7-ERE cells. But in MCF-7 transfected with pERE-Luc, E2 did not have effect on HDACs inhibitors induced luciferase activity. Effects of HDAC inhibitors on MCF-7 cell number was examined and results showed that cell were arrested at G_(2)-M phase and undergo through apoptosis in dose and time dependent manner. Expression of cytochrome 1B1 gene induced by polyaromatic hydrocarbones (PAHs) like TCDD and 3-MC. CYP1B1 enzyme metabolize PAHs and estradiol. CYP1B1 metabolize E2 to 4-hydroxyestradiol that is considered as carcinogenic metabolite. In order to study the effect of transcriptional regulatory mechanism on the regulation of human CYP1B1 expression, 5' flanking DNA of human CYP1B1 was cloned into pGL3 basic vector encoding luciferase gene and phCYP1B1-Luc was transfected into human breast cancer cell line MCF-7 cells. Luciferase activity was induced 20-30 folds over that control by 1 nM TCDD (2,3,7,8-tetrachloro-p-dioxin) and 10 μM 3-MC treatment and these inductions were dose dependent. 2,3,4,5'-tetramethoxystilbene (TMS) that is CYP1B1 selective inhibitor, inhibited luciferase activity induced by TCDD but had no effect on luciferase activity induced by 3-MC. These indicated that TCDD and 3-MC have different pathway to induce CYP1B1. We observed effect of hypoxia on CYP1B1. CoCl2 which is hypoxic chemical, decreased luciferase activity induced by TCDD. All HDAC inhibitors that used, increased CYP1B1 transcription and TCDD induced CYP1B1 transcription. Luciferase activity was induced Benzo(k)fluoroanthracene and Dibenzi(a,h)anthracene treatment and these inductions were dose dependent. 10^(-8) M E2 increased luciferase activity induced by 10^(-10) M TCDD treatment. But diethylstillbestrol (DES) is not metabolized by CYP1B1, did not affect on luciferase activity induced by 10^(-10) M TCDD treatment. These are shown possibility that E2 metabolite have inhibitory on CYP1B1 transcription.
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