View : 14 Download: 0

Altered expression of collapsin response mediator-2 in focal ischemic rat brain and hypoxia-induced PC12 cells

Title
Altered expression of collapsin response mediator-2 in focal ischemic rat brain and hypoxia-induced PC12 cells
Authors
정명아
Issue Date
2003
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
The cellular response to ischemia or hypoxia involves a series of metabolic and biosynthetic events associated with adaptation to a hypoxic environment, including the expression of a number of physiologically important proteins. The ischemia-induced changes in protein expression may provide important insights into the mechanisms of cellular damage and their potential recovery. Using proteomic analysis, we identified the several proteins whose expression level was clearly different under ischemic condition. 2D spots that show consistent increase or decrease in repeated experiments were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry. In ischemic cortex, the expression level of collapsin response mediator proteins-2 (CRMP-2) was increased. CRMP-2 might be a candidate new molecule that could play an important role in brain ischemic condition. CRMP-2, which has also been identified as TOAD-64 (TUC-2), CRMP-62, Ulip-2 and DRP-2, is one of at least 5 isoforms and is involved in axonal growth and guidance in the nervous system. It was originally identified as a mediator in semaphorin-induced growth cone collapse. Mutation of CRMP-2 results in abnormal axon termination of many neurons, and overexpression of CRMP-2 induces the multiple axons like structure. CRMP-2 may be also involved in the process of neurodegeneration, Alzheimer's disease brain, and in a dopamine-induced apoptotic neuronal cell death. The expression patterns of CRMP-2 were examined in the cortical and striatal tissues from middle cerebral artery (MCA)-occluded rat brain and in the hypoxia-induced pheochromocytoma (PC12) cells by Western blot analysis using a monoclonal CRMP-2 antibody. The expression levels for the major 62 kDa band with highest density in normal tissues and cells were gradually diminished according to the ischemic or hypoxic duration. While the newly detected lower 58 kDa band density was clearly increased up to 48 hr of MCA occlusion. In PC12 cells, cell viability was decreased by hypoxia induction (0% O_(2), 5% CO_(2), 10% H_(2) and 85% N_(2)) time-dependently, and the hypoxia-induced cytotoxic effect was accelerated by glucose deprivation, but not by serum deprivation. The 58 kDa expression was increased until the cell viability was 20-30%, and then gradually disappeared at longer hypoxic with higher cytotoxic conditions. When cell death progressed maximally by other cytotoxic agents observed as in glucose-serum deprivation hypoxia, the CRMP-2 expression was decreased. However, in under-maximal cytotoxic condition, the change of CRMP-2 expression pattern is likely to be different from that in ischemic or hypoxic condition. Cells treated with LPS or H_(2)O_(2) at relatively high concentration that induce the significant poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage had no change of the 62 kDa band expression level and an appearance of the lower CRMP-2 band. No effect of nerve growth factor (NGF)-induced differentiation on levels of CRMP-2 protein was also observed in PC12 cells. It can be postulated that the differentially changed bands observed in ischemic rat brain and hypoxia-induced PC12 cells by CRMP-2 antibody represent distinct isoforms of CRMP-2 generated as results from alternative mRNA splicing, proteolysis, or its post-translational modified products. We could not observe the possibility of alternative splicing of CRMP-2 mRNA or phosphorylation during ischemic or hypoxic condition. The possibility of proteolysis was tested by MALDI-TOF MS analysis. The 58 kDa protein was cleavage form of CRMP-2 and cleavage site was predicted in C-term of CRMP-2. Further studies regarding the role of CRMP-2 in ischemic and hypoxic condition would provide a useful clue to elucidate pathophysiological mechanisms and therapeutic strategies of stroke. ;허혈 발생시 특이적으로 나타나는 단백질의 발현 변화에 관한 연구는 허혈에 의한 생체내의 세포 손상 기전을 이해하고 치유방법을 제안 하는데 중요한 단서로 제공될 수 있다. 허혈을 일으킨 동물 모델의 뇌 조직과 정상 조직에서 나타나는 단백질의 발현 양상을 2D-PAGE 분석을 통해 비교 한 후, 발현 변화가 나타나는 단백질로서 최신 peptide data에 의거하여 collapsing Response Protein-2 단백질을 동정할 수 있었다. CRMPs는 신경계 발달을 조절하는 세포내 단백질 중 하나로, 특히 정상적인 신경돌기를 생성하는 발달 초기 상태에서와 microtubule의 운동성을 조절하는 데에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있으며, Semaphorin 3A와 관련하여 인산화 과정을 통한 세포내 신호 전달 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. CRMP 단백질 군 중, CRMP-2는 CRMPs 중 가장 많이 발현되어있으며, 특히 신경계 발달 초기와 일부 성숙한 신경계에서 발견되고, 신경세포 안의 growth cone, axon, cell body등에 분포하는 것으로 알려져 있다. 또한 신경계 질환과 관련하여 알츠하이머가 발병된 뇌 조직에서 CRMP-2가 인산화 된다는 보고가 있으나, 아직까지 뇌허혈과의 관련성은 밝혀져 있지는 않다. 본 실험에서는 앞선 연구를 통하여 나타난 것과 같이 CRMP-2가 뇌허혈을 일으킨 뇌조직에서 발현 변화 양상을 관찰하기 위해 monoclonal CRMP-2 antibody (C4G)를 사용하여 Western blotting을 한 결과 66 kDa와 62 kDa으로 나타나는 CRMP-2의 주된 band가 아닌 58 kDa 의 이제까지 보고되지 않은 size의 CRMP-2 단백질의 발현이 증가한다는 사실을 얻어냈다. 또한 뇌허혈 상태와 유사하다고 보고된 저산소증을 유발시킨 세포에서도 마찬가지로 저산소 배양 시간이 증가 할수록, 62 kDa 는 감소하는 반면, 새로운 58 kDa 발현은 증가하는 것이 관찰되었다. 저산소 배양 조건에서, 세포의 사멸 정도와 관련시켜 보았을 때 전체 cell의 20-30%의 cell 생존도를 나타낼 때 58 kDa가 나타나는 것으로 관찰되었다. 저산소상태의 cell 생존도에 영향을 미치는 요인을 알아보기 위해 serum과 glucose의 조성을 조절해 본 결과 serum보다는 glucose가 더 중요한 요소로 작용하여 glucose없이 저산소 배양된 경우가 cell death가 촉진되는 결과를 보였고 이에 따라 58 kDa 단백질도 serum 없이 저산소 배양했을 때 보다 빨리 나타나는 것으로 관찰되었다. 저산소 자극으로 인한 cell death 에서 나타나는 58kDa 발견되는 현상은 다른 cytotoxic agent에 의한 apoptotic cell death 에서는 관찰 할 수 없었으며, 이는 cell death가 일어날 때 활성화 되는 caspase에 의해 CRMP-2가 조절되지는 않는 것으로 결론 내릴 수 있다. 역시 cell death에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 calpain에 의한 CRMP-2의 조절 가능성을 실험해 보았으나, 이는 생화학적인 단백질 연구가 요구된다. 이렇게 새롭게 발현 증가되는 58kDa CRMP-2 단백질이 나타나게 되는 원인으로서 몇 가지 가능성을 가지고 연구해 보았다. 첫번째로 저산소 자극이나 허혈로 인한 자극을 받았을 경우 단백질 생성과정에서 나타난다고 알려진 mRNA의 alternative splicing 현상에 대한 증거를 본 실험에서는 찾아볼 수 없었으며, 인산화에 의한 단백질의 modification도 아닌 것으로 나타났다. 마지막으로 proteolysis작용에 의해 CRMP-2가 cleavage된 형태로 나타날 수 있다는 가능성을 가지고, 면역 침강 반응을 통하여 SDS-PAGE 상에서 나타나는 band를 그대로 trypsin으로 digestion하여 MALDI-TOF분석을 시행한 결과, 저산소 상태에서 배양했을 때 나타나는 58 kDa 단백질은 CRMP-2 단백질이 cleaved된 형태이며, 카르복실 말단에서 cleaved 형태인 것으로 밝혀졌다. 본 연구에서는 CRMP-2가 뇌졸중 질환과 관련되어 저산소 또는 허혈로 인한 세포 사멸 과정에서 proteolysis에 의하여 cleaved된 새로운 형태의 CRMP-2가 나타나는 것이 밝혀졌으며, 이는 뇌졸중에서 나타나는 cell death에 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 이러한 실험 결과를 바탕으로, cleavage CRMP-2 form을 이용하여 뇌졸중과 저산소증 질환에서의 CRMP-2의 기능을 연구가 앞으로 진행되어야 할 것이며 이는 뇌졸중의 병리 기전을 좀더 명확히 이해하고, 허혈의 원인 규명이나 치료제 개발에 단서를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
Fulltext
Show the fulltext
Appears in Collections:
일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
Files in This Item:
There are no files associated with this item.
Export
RIS (EndNote)
XLS (Excel)
XML


qrcode

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

BROWSE