Pinosylvin 및 그 유도체의 Cyclooxygenase-2(COX-2) 및 Inducible Nitric Oxide Synthase(iNOS) 저해 활성에 관한 연구

Abstract

암은 현대인의 건강을 위협하는 최대의 질병으로서, 전 세계적으로 매년 6백만명이 암으로 사망하고 있다. 우리나라의 경우도 예외는 아니어서, 2002년에 발표된 통계청 자료에 의하면, 전체 사망자 24만 여명 가운데 6만 여명이 암으로 사망한 것으로 나타났다. 이 와 같 이 지난 수십 년간 암을 치료하기 위해 약물 요법을 비롯하여 방사선 요법, 수술 요법 등을 개발하였음에도 불구하고 평균 수명의 연장, 환경오염 및 스트레스의 증가 등으로 인해 암으로 인한 사망률은 줄어들지 않고 있다. 따라서, 암이 생성되기 이전에 암을 예방하려는 화학적 암예방이 경제적이고 효율적인 접근 방법으로 인식되고 있다. 대표적인 암예방 물질 중의 하나로 적포도주의 성분인 resveratrol (3, 4', 5-trihydroxy- trans-stilbene)이 알려져 있으며, 염증을 매개하는 효소인 cyclooxygenase-2 (COX-2) 및 inducible nitric oxide (iNOS)의 발현과 활성을 저해함으로써 암의 생성 및 진행을 억제한다고 밝혀져 있다. 따라서, resveratrol과 구조 유사체인 소나무 심재 및 솔잎에 존재하는 pinosylvin (3,5-dihydroxy- trans-stilbene)도 이와 비슷한 효과가 있을 것으로 예상하고, COX-2 및 iNOS에 대한 저해 활성을 평가해 보았다. 저해 활성은 RAW 264.7 마우스 대식세포에 lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 유도되는 COX-2 및 iNOS의 생성물인 prostaglandin E_(2) (PGE_(2))와 nitric oxide (NO)의 생성량으로 평가하였다. 그 결과, pinosylvin은 PGE_(2) 및 NO 생성을 농도 의존적으로 감소시켰고, 따라서 어떠한 작용기전에 의해 저해 활성이 있는지 좀 더 연구해 보았다. 우선, PGE_(2)의 생성의 저해는 직접적인 COX-2 효소활성의 저해와 COX-2 단백질 및 유전자 발현의 저해에 의한 것으로 확인하였다. 다음으로, NO 생성의 저해는 직접적인 iNOS 효소 활성의 저해가 아니라, 단백질 및 유전자 발현에 대한 저해 작용임을 알 수 있었다. Pinosylvin이 COX-2와 iNOS의 단백질 및 유전자 발현을 저해한다는 사실을 밝혔으므로, 유전자의 발현을 조절하는 NF-κB, AP-1, C/EBP 등 transcription factor에 대한 DNA 결합 저해 활성을 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 통해 확인하였다. 그 결과, pinosylvin은 NF-κB, AP-1의 DNA 결합을 저해한 반면, C/EBP에 대해서는 영향을 미치지 않았다. 다음으로, NF-κB의 DNA 결합 저해 활성에 따라, NF-κB의 핵 내 이동을 저해하는 IκB의 분해에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였으며, 농도 의존적인 IκB의 분해를 저해함을 알 수 있었다. Pinosylvin이 RAW 264.7 마우스 대식세포에서의 COX-2 및 iNOS에 대한 저해 활성을 가지므로, 실제 인간 암 세포주 중 COX-2를 과발현하는 HT-29에 대해서 Sulforhodamine B (SRB) 법, 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)법, colony formation 실험 등을 수행하여 암세포 성장 저해 능력을 평가해 보았으며, 그 결과 HT-29에 대한 세포 성장 저해 효과를 확인할 수 있었다. 이상의 결과들로부터, pinosylvin 은 COX-2와 iNOS를 저해함을 알 수 있으며 암세포 성장을 억제할 수 있으므로, 항염증제 뿐 아니라 암 예방제로서의 가능성이 크다고 여겨진다. 위에서 pinosylvin의 COX-2 및 iNOS 저해 활성을 확인하였으나, 그 효능은 resveratrol과 유사하였다. 따라서 좀 더 탁월한 효능을 가진 물질을 개발하기 위해 pinosylvin의 유도체를 합성하였고, 이들의 COX-2 및 iNOS 활성을 검색하였다. 그 결과, trans-piceid, compounds 1, 4, 6-8에서 모두 농도 의존적으로 PGE2의 생성을 감소시키는 것으로 나타났으며 특히, compound 1의 저해 효과는 상당히 우수하였다. 또한, compound 6의 경우 iNOS에 대한 저해 효과을 동시에 가지고 있었다. 다음으로, resveratrol이 항산화 활성을 가지고 있다고 알려져 있으므로 pinosylvin과 그 유도체에 대해서 항산화 활성을 평가해 보았다. 그 결과, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 실험에서는 pinosylvin, trans-piceid 가 저해 활성을 나타내었고, xanthine/xanthine oxidase (X/XO) 실험에서는 pinosylvin의 활성이 뛰어났다. 또한, 여러 종류의 인간 암 세포에 대한 pinosylvin과 그 유도체의 세포 성장 저해를 SRB 법을 통해 확인한 결과, pinosylvin , trans-piceid, compound 4, 6에서 성장억제 효과를 보였고, 특히 t rans-piceid의 경우 위암 세포주에 선택적이었다. 이상의 결과들을 정리하면 compound 1은 COX-2 저해 활성이 뛰어났으며, compound 6은 COX-2 및 iNOS 저해 활성을 동시에 나타냈으므로, compound 1과 6은 효과적인 항염증제 뿐 아니라 암예방제로서의 가능성이 크다고 할 수 있겠다. 또한, trans-piceid의 경우 위암 세포주에 대해 선택적인 세포 성장 억제 작용을 보였으므로, 선택적인 암예방제 혹은 항암제로서의 가능성이 있다고 생각된다.;The inhibitors of prostaglandin biosynthesis and nitric oxide production by corresponding inducible isozymes, cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) have been considered as potential antiinflammatory and cancer chemopreventive agents. In our continuous search for cancer chemopreventive agents from natural products or synthetic chemicals, we have evaluated the inhibitory potential of prostaglandin E_(2) (PGE_(2)) and nitric oxid (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-induced mouse macrophage RAW264.7 cells. As a result, pinosylvin (3,5-dihydroxy- trans-stilbene), a stilbenoid, mainly found from the heartwood and leaves of the Pinus sylvestris, showed potential inhibitory activity of LPS-induced PGE_(2) and NO production in a dose-dependent manner. Pinosylvin also inhibited PGE_(2) production in COX-2 emzyme activity model, but there was no influence on NO production in iNOS enzyme activity model. Pinosylvin also suppressed the LPS-induced COX-2 and iNOS protein and gene expression. To further elucidate the inhibitory mechanism of pinosylvin on COX-2 and iNOS gene expression, pinosylvin was performed the effect of transcription factor binding activity using electrophoretic mobility shift assay (EMSA). As a result, pinosylvin inhibited NF-κB and AP-1 binding activity, while no effect on C/EBP. Further study revealed that pinosylvin inhibited IκB-α degradation in LPS-stimulated macrophage cells. Pinosylvin was also showed antioxidant activity by 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging and xanthine/xanthine oxidase inhibitory potential. In addition, pinosylvin inhibited human colon cancer cell (HT-29) growth in a time- and dose-dependent manner. Next, we have evaluated the inhibitory effects of pinosylvin analogs on COX-2, iNOS, DPPH, X/XO, and SRB assay. As a result, compound 1, and 6 was found to have significant inhibitory effects on COX-2, and compound 6 also exhibited suppressive effect on iNOS. In SRB assay, trans-piceid showed selective cell growth inhibition on gastric cancer cell line. These findings suggest compound 1, compound 6, and trans-piceid might be promising candidates for developing cancer chemopreventive agents.