CYP3A4 유전자 조절 기전 연구 및 CALUX bioassay 기법 확립

Abstract

사람들은 환경 중 오염물질로 유기체들의 불완전 연소로 생기는 PAHs (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons)에 쉽게 노출이 된다. PAHs는 AhR (Arylhydrocarbon Receptor)의 강력한 효능제이다. 세포에서 cytochrome P4501A1 (CYP1A1)의 유도는 AhR 활성에 대한 파라미터로 사용된다. PAHs는 또한 cytochrome P450에 의하여 활성화된다고 알려진다. 본 눈문에서는 PAHs가 CYP1에 미치는 영향을 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포와 생쥐 간 세포인 Hepa-I 세포에서 생물학적 활성을 측정하였고, 두 세포에서의 활성을 비교하였다. 우리는 13 개의 다른 PAHs와 2 개의 PAHs의 혼합물과 환경 시료의 추출물로 활성을 측정하였다. PAHs에 의해 유도된 CYP1A1-luciferase reporter gene, 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) 활성과 CYP mRNA의 발현을 측정하였다. MCF-7 세포와 Hepa-I 세포에 각각 일시적으로 phCYP1A1-Luc와 pmcyp1a1-Luc를 transfection 하였다. TCDD의 CYP1A 유전자 발현보다 강한 반응을 보이는 PAHs는 없었다. MCF-7 세포에서는 benzo(k)fluoranthene과 dibenzo(a,h)anthracene은 농도 의존적으로 CYP1A1 유전자 발현 증가, EROD 활성 유도와 CYP1A1 및 CYP1B1 mRNA의 발현을 증가시켰다. 그러나 Hepa-I 세포에서는 benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene, chrysene와 dibenzo(a,h)anthracene는 cyp1a1 유전자 발현 증가, EROD 활성 유도와 cyp1a1 mRNA의 발현을 증가시켰다. MCF-7 세포에서 Benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene과 chrysene은 약한 반응을 보였다. RT-PCR 결과 PAHs가 뚜렷하게 CYP1A1·CYP1B1 mRNA의 발현을 증가시켰다. 두 개의 PAHs를 혼합하였을 때, 상승 및 상가 작용이 없었다. PM2.5 (디젤 엔진 미세 분진)을 제외한 환경 시료 추출물은 CYP1A1에 영향이 없었다. PM2.5는 CYP1A1에 강한 반응을 보였다. Cytochrome P-450 3A4 (CYP3A4)는 사람 간에 주로 존재하는 효소로, 해독과 임상 약물의 50%를 대사하는 역할을 한다. CYP3A4의 전사 조절은 Pregnenolone X Receptor (PXR), 사람에 존재하는 형태인 Steroid and Xenobiotics Receptor (SXR)에 의하여 조절된다. SXR은 내인성과 외인성 물질에 의해 활성화된 후, CYP3A4 유전자 발현을 유도한다. 본 논문에서, CYP3A4 proximal promoter (-863 ~ +64)를 상단에 포함하고 있는 luciferase reporter gene을 만들었다(phCYP3A4p-Luc). CYP3A4에 대한 dexamethasone, estradiol, pregnenolone 16α-carbonitrile (PCN), rifampicin, RU-38486 (mifepristone)과 같은 유도제의 반응을 HepG2 세포에서 살펴보았다. SXR에 의한 CYP3A4의 전사 활성을 보기 위한 정량법을 정립하였다. HepG2 세포에 phCYP3A4p-Luc을 transfection한 후, Histone DeACetylase 저해제 (HDAC 저해제)인 IN2001, Trichostatin A와 HC-toxin을 유도제와 같이 처치하였을 때, luciferase 활성이 대조군에 비하여 증가하였다. phCYP3A4XREM-Luc은 CYP3A4XREM (distal Xenobiotics Response Enhance Module -8000 ~ -7200 bps)를 포함하고 있는 plasmid이다. HepG2 세포에 phCYP3A4XREM-Luc과 hSXR을 일시적으로 동시에 transfection하였다. HDAC 저해제와 동시에 처치하였을 때에만 반응이 나타났다. HepG2 세포에 phCYP3A4p-Luc, phCYP3A4XREM-Luc, hSXR를 transfection 하였을 때, SXR이 두 유전자에 대하여 경쟁적인 영향을 나타내었다. HepG2 세포에 HDAC 저해제를 처치하였을 때, 생체 외 실험에서 세포 증식을 억제하였고, G0/G1 arrest를 일으켜서 세포 사멸을 유발하였다. ;Recent industrialized society, human has been widely been exposed to widespread environmental contaminants such as PAHs (Polycyclic Aromatic Hydrocarbon) that are originated from the incomplete combustion of hydrocarbons. PAHs are known to be ligands of the AhR (Arylhydrocarbon Receptor). Induction of cytochrome P4501A1 (CYP1A1) in cell culture is widely used as a biomarker for PAHs. Therefore we have studied the effect of PAHs in the human breast cancer cell MCF-7 and mouse hepatocyte cells Hepa-I to evaluate bioactivity of PAHs. We have used the United State of America EPA selected 13 different PAHs, PAHs mixtures and extracts from environmental samples to evaluate the bioassay system. We examined effects of PAHs on the CYP1A1-luciferase reporter gene, 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) activity and CYP mRNA level. MCF-7 cells and Hepa-I cells were transiently transfected with phCYP1A1-Luc and pmcyp1a1-Luc, respectively. None of the PAHs tested showed stronger stimulatory effect on the CYP1 gene expression than TCDD. Benzo(k)fluoranthene and dibenzo(a,h)anthracene showed strong response to CYP1A1 promoter activity stimulation, EROD induction and also CYP1A1 and CYP1B1 mRNAs increase in MCF-7 cells in a concentration-dependant manner. However, Benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene, chrysene and dibenzo(a,h)anthracene showed strong response to cyp1a1 promoter activity stimulation, EROD induction and cyp1a1 mRNA increase in Hepa-I cells. Benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene and chrysene were weak responders in MCF-7 cells. RT-PCR analysis indicated that PAHs significantly up-regulate the level of CYP1A1 and CYP1B1 mRNA. Results of mixture showed no additive or synergistic effect on luciferase, EROD and 1A1 mRNA level. The extracts from environmental samples except PM2.5 (dusts less than 2.5 μm in diameter) does not significantly affect CYP1A1 gene expression. Cytochrome P-450 3A4 (CYP3A4) is one of the major enzyme in human liver, involved in the detoxification and metabolizing more than 50% clinical drugs in use. The transcription of CYP3A4 is regulated by the Pregnenolone X receptor (PXR), of which human form is Steroid and Xenobiotics receptor (SXR). SXR is activated by wide range of endogenous and exogenous compounds, and then induces CYP3A4 gene expression. In this study, We made CYP3A4 proximal promoter (-863 to +64) upstream containing luciferase plasmid (phCYP3A4p-Luc), in order to evaluate responses of inducers such as dexamethasone, estradiol, pregnenolone 16α-carbonitrile (PCN), rifampicin and RU-38486 (mifepristone) in terms of transcription of phCYP3A4p-Luc in cultured cells. When HepG2 cells were transfected transiently with phCYP3A4p-Luc, the luciferase activity was induced over the control with the induces such as dexamethasone, estradiol, pregnenolone 16α-carbonitrile (PCN), rifampicin and RU-38486 (mifepristone) in the present of histone deacetylase inhibitor (HDAC inhibitor), such as IN2001, trichostatin A and HC-toxin. When HepG2 cells were cotranfected transiently with phCYP3A4XREM-Luc that contains CYP3A4XREM (distal Xenobiotics Response Engnace Module -8000 ～ -7200 bps) and hSXR and promoter activity was examined. The stimulation of phCYP3A4XREM promoter activity in the present of hSXR was observed with CYP3A4 inducing chemicals only when HDAC inhibitors were added concomitantly. When HepG2 cells were transfected with phCYP3A4-Luc, phCYP3A4XREM-Luc and hSXR, the competition between phCYP3A4p-Luc and phCYP3A4XREM-Luc for SXR have been observed. Furthermore, in this study, effects of HDAC inhibitors on human liver cancer cell proliferation were examined. Results showed HDAC inhibitors inhibit cell numbers by arresting at G0/G1 and causing apoptosis.