Na-K-ATPase와 HRF의 상호작용 기전과 Apoptosis에서 나타나는 Na-K-ATPase의 변화연구

Abstract

Na-K-ATPase의 세 번째 cytosolic loop은 yeast two hybrid assay 결과 IgE-dependent histamine releasing factor (HRF)와 상호작용하는 것으로 알려졌고 또 caspase 3가 자를 수 있는 sequences를 가지고 있다. 그러므로 본 실험에서는 caspase 3가 Na-K-ATPase를 잘라낼 수 있는지의 여부와 HRF가 Na-K-ATPase와 상호작용하는 기전에 대하여 연구하였다. Apoptosis는 세포내 ion 중 특히 potassium 농도가 드라틱하게 변화하여 나타나는 cell shrinkage, membrane blebbing의 merphological change를 특징적으로 나타내는 programmed cell death이다. 따라서 ion의 출입을 관장하는 Na-K-ATPase가 apoptosis의 초기에 관여할 수 있으나 아직 이 효소가 어떠한 방식으로 관여하는지에 대해 연구된 바는 없다. 본 실험에서는 Na-K-ATPase의 multiple alignment를 실시하여 이 효소의 3rd cytosolic domain에 caspase-3에 의해 잘릴 수 있는 DXXD sequence 가 있음에 착안하여, 그 sequence가 있는 3rd cytosolic loop만을 subcloning하여 in vitro에서 발현한 후 caspase에 의해 잘리는지의 여부를 확인하였다. 또한 apoptosis를 일으키고 있는 Cos-7 cell에서도 caspase 3가 Na-K-ATPase를 잘라내는지 확인하였다. 그 결과 Na-K-ATPase의 세번째 cytosolic loop domain은 in vitro에서 ATP가 존재하는 조건아래, caspase 3에 의해서 partial cleavage가 일어나며 다른 caspase 2, 6, 7, 8, 9, 12에 의해서는 전혀 잘리지 않았다. Cos-7 cell에 staurosporine을 처리하여 인위적으로 apoptosis를 일으켜 caspase 3를 활성화했을 때에도 Na-K-ATPase가 partial cleavage를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 본 실험은 세포내 ions의 출입을 조절하는 주요 효소인 Na-K-ATPase가 caspase 3에 의해 부분적으로 잘릴 수 있는 기질이 될 가능성을 제시하는 동시에 caspase 3가 작용하기 위해서는 DXXD 라는 특정 아미노산 서열 외에도 기질의 특정한 분자구조 또한 필요하다는 사실을 제시할 수 있다. 더불어 apoptosis가 일어날 때 나타나는 세포내 ion 농도의 변화에 caspase 3가 Na-K-ATPase에 상호작용하여 부분적으로 영향을 미칠 수 있는 가능성을 제시하여 apoptosis에서 일어나는 세포내 변화를 Na-K-ATPase가 포함된 pathway로서 고찰할 수 있게 되었다. HRF는 IgE와는 구별되는 signal pathway를 가지고 mast cell, basophils에서 histamine의 분비를 조절하는 단백질로 알려져 있다. 본 실험실에서는 HRF가 Na-K-ATPase의 세 번째 cytosolic loop에 결합하며 98-100번째 amino acid의 SIK라는 PKC 인산화 잔기에서 PKC에 의해 인산화됨을 밝혀내었다. 아울러 immunoprecipitation을 통해 HRF는 protein phosphatase 2B/calcineurine에 의해서 탈인산화될 수 있다는 사실도 발견하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 본 연구에서는 HRF가 Na-K-ATPase와 상호작용을 할 때에는 Na-K-ATPase의 세 번째 cytosolic loop과 결합하며 HRF의 인산화/탈인산화 형태에 따라 상호작용 여부가 달라짐을 in vitro에서 affinity chromatography와 pull-down assay 방법을 통해 알아보아 탈인산화된 형태의 HRF가 Na-K-ATPase와 상호작용한다는 사실을 확인하였다. 또한 Cos-7 cell에 hemagglutinin이 표지된 HRF를 transfection하여 다양하게 약물을 처리하고 immunoprecipitation을 통해 HRF와 결합된 Na-K-ATPase를 detection하였다. 동시에 RBL-2H3 cell에 약물을 처리했을 때 histamine의 spontaneous release가 어떻게 영향받는지를 살펴보고 약물 자체에 의한 histamine 분비 효과가 있는지의 여부와 HRF의 인산화/탈인산화에 따른 histamine 분비 변화를 살펴보아 PKC와 phosphatase에 작용하는 약물은 histamine 분비에 영향을 미친다는 사실을 확인했다. 따라서 본 실험은 탈인산화된 HRF가 Na-K-ATPase의 세 번째 cytosolic loop domain에서 상호작용한다는 것을 다양한 방법으로 confirm하였고 immunoprecipitaion을 통해 in vivo에서도 HRF가 Na-K-ATPase와 결합한다는 것을 확인했으며 HRF의 인산화/탈인산화에는 PKC alpha, delta, PP2B가 관여한다는 것을 밝혀내어 HRF 인산화 조절이 histamine 분비에 미치는 영향과 그 조절 메카니즘을 고찰할 수 있게 되었다.;The 3rd cytoplasmic loop of Na-K-ATPase was found to interact with IgE-dependent histamine releasing factor (HRF) using yeast two hybrid assay and contain the suspected sequences of caspase 3 cleavage site. In this study, I investgated whether caspase 3 could cleave Na-K-ATPase and how HRF could interact with Na-K-ATPase. Apoptosis is the programmed cell death characterized with specific morphological changes like cell shrinkage and membrane blobbing, and accompanied by the dramatic changes of intracellular ion concentrations, especially intracellular potassium concentration in the process of apoptosis. Obviously, the Na-K-ATPase which regulates the intracellular ions could affect the initiation of apoptosis. However, the mechanisms how this enzyme can affect to initiate apoptosis are unknown until now. In this study, the sequences of Na-K-ATPase isotypes was multiple-aligned and searched for the specific caspase 3 cleavage sequences, DXXD, in the cytosolic domains of Na-K-ATPase. The 3rd cytosolic loop having the specific DXXD sequences was subcloned, expressed, and tested whether these peptides were cleaved by caspase 3 or not. Cos-7 cells on apoptosis also studied whether Na-K-ATPase could cleaved by caspase 3 in vivo. The 3rd cytosolic loop of Na-K-ATPases partially cleaved by caspase 3only in the presence of ATPs but not Mg^(2+)and vanadate, and not cleaved by other caspases, such as caspase 2, 6, 7, 8, 9 and 12 in vitro. The apoptotic Cos-7 cells caused by staurosporine showed the activation of caspase 3 and PARP cleavage, and the purified Na-K-ATPase from the apoptotic Cos-7 cells was also partially cleaved. These results suggest that caspase 3 recognizes the specific conformation of the 3rd loop of Na-K-ATPase containing the DXXD sequences and the Na-K-ATPase maybe the potential substrate of caspase 3 during the process of apoptosis. HRF is known to have the signal pathway distinct from IgE and it is known as the regulator of histamine release in mast cells and basophils. In our lab, it has been show that HRF interacts with 3rd cytoplasmic domain of the alpha subunit of Na-K-ATPase and is phosphorylated at ^(98)SIK amino acid sequence, by PKC. Furthermore, immunoprecipitation experiments demonstrated that HRF could be dephosphorylated by protein phosphatase 2B/calcineurine. Based upon these observations, I investigated whether the phosphorylation of HRF affect the binding to Ha-K-ATPase using affinity chromatography, pull-down assay and subcellular fractionation method. Furthermore, Cos-7 cell extracts transfected with hemagglutinin (HA) tagged HRF plasmid and treated with PKC activators or PKC inhibitors or phosphatase inhibitors were then immunoprecipitated using anti-Na-K-ATPase antibody. The data showed that dephosphorylated HRF might interact with the Na-K-ATPase in RBL-2H3 as well as Cos-7 cells. Therefore, I propose that the phosphorylation and dephosphorylation of HRF by PKC and/or phosphoatases, such as PKC alpha, delta and PP2B, may regulate the histamine degranulation.