The functional study of TRAF6 in TNF and LPS signaling

Abstract

TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6)는 TNF receptor superfamily와 IL-1/TLR receptor superfamily에서 중요한 adaptor 단백질로써 그 기능이 연구되어 있다. 이 단백질은 선천성 면역뿐만 아니라 적응성 면역 반응에 걸쳐 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 본 논문에서는 두 가지 서로 다른 신호 전달 체계에서의 TRAF6의 새로운 기작을 연구하였다. 첫 번째 장에서는 TNFR1 신호 전달에 있어서의 TRAF6의 역할을 조명하였다. TNFR1 신호는 NF-kB를 통한 세포 생존 기작과 활성 산소 축적에 의한 지속적인 JNK 활성에 의한 세포 사멸 기전 모두를 조절한다. 그래서 세포 생존에 있어서 NF-kB 활성의 중요성은 이 신호 전달 체계에 주요 단백질로 알려진 TRAF2나 p65/RelA 유전자의 knock-out 실험을 통해 증명되기도 하였다. 하지만 TRAF6의 연관성에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없었다. 먼저 TRAF6가 없는 세포에 TNF를 처리하였을 때, TNF에 반응하여 세포가 죽는 것을 관찰하였다. 이것은 위에서 말한 NF-kB 활성에 필수적이 단백질들의 결핍에서 오는 결과와 같은 현상으로 TRAF6가 TNF 신호전달에 관여한다는 것을 보여준 것이다. 또한 TRAF6가 없는 세포에서 세포 사멸의 원인으로 알려진 활성 산소의 축적과 이로 인한 JNK의 지속적인 활성도 확인하였다. 이러한 현상은 정상 세포에서는 전혀 관측되지 않았다. 이것은 TRAF6가 없는 것으로 인해, TNF에 의한 NF-kB 인산화와 NF-kB 활성에 의한 세포 사멸 억제 유전자 발현 기능이 현저하게 떨어졌기 때문이다. 지금까지의 현상은 TRAF2가 결핍된 세포에서도 비슷하게 나타나는 것으로, TRAF6가 TRAF2와 기능적인 유사성에 의한 역할을 수행한다고 예측할 수 있었다. 하지만 TRAF6가 없는 세포에서만 PI3K-Akt가 비정상적으로 높게 활성화되어 있었고, 이러한 비정상적인 활성은 결과적으로 GSK3b라는 단백질을 강하게 억제하였다. 앞의 결과는 PI3K 억제 물질을 처리하거나, 계속적으로 활성 되어있는 GSK3b 단백질을 과 발현 시켰을 경우 세포 사멸이 줄어드는 것을 통해 다시 한번 확인할 수 있었다. 그러므로 이상의 결과로 볼 때, TRAF6는 PI3K-Akt-GKS3b의 활성을 적절하게 조절함으로써, TNF 자극에 의한 세포 생존 유지에 필수적인 역할을 수행함을 알 수 있다. 두 번째 장에서는 TRAF6의 기능을 LPS에 의해 매개되는 신호 전달 체계에서 연구하였다. TLR 신호 전달계는 외부에서 오는 감염성의 병원체 등의 미생물을 1차적으로 인식하여 반응하는 수용체들로 이것은 또한 적응성의 면역 반응을 증폭시키는 역할을 한다. 여기서 LPS는Gram-negative 박테리아의 외벽의 일부분으로 TLR4가 인식하여 반응한다. TLR4는 NF-kB와 IFNb에 의해 매개되는 특정 유전자 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이 신호 전달계에서의 TRAF6의 역할은 이미 잘 밝혀져 있는데, TRAF6는TAK1 단백질 복합체의 활성을 증가시킴으로써 전사 조절 인자를 활성화하는 역할을 한다. 이때 TRAF6의 번역 후의 변형 (post-translational modification) 즉, K63-linked polyubiquitination이 중요한 것으로 보고되어 있지만, 어떻게 그 변형이 증가되는지는 정확하게 밝혀지지 않았다. 한편, 최근 보고에 의하면 NADPH oxidase 4 (NOX4)에 의해 생성된 활성 산소는 NF-kB를 활성화시키는데 있어 매우 중요함을 알 수 있었지만, 이 또한 자세한 조절 기작은 밝혀지지 않았다. 그래서 본 논문에서는 TRAF6의 기능을 NOX4와의 상호 작용에 초점을 두어 그 기작을 규명하고자 하였다. 먼저 TRAF6가 없는 섬유아세포에서 LPS에 반응하여 활성 산소의 생성이 현저하게 감소되어 있음을 확인했다. 이것은 섬유아세포에 지배적으로 많은 NOX4의 발현 감소에서 오는 결과임을 알 수 있었고, 이러한 NOX4의 발현 정도는 TRAF6에 의해 조절 받음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들을 통해 TRAF6가 NOX4의 발현을 조절함으로써 활성 산소의 발생에 중요한 역할을 함을 예측할 수 있었다. 게다가 NOX4는 TRAF6와 결합하여 TRAF6의 자가 변형 (self-modification)을 더욱 증가 시켰다. 이는 siRNA를 이용한 NOX4의 유전자의 불활성화에 의해서 TRAF6의 ubiquitination 완전히 감소함을 통해 뒷받침할 수 있다. 이러한 NOX4에 의한 TRAF6의 ubiquitination은 NF-kB 전사를 촉진시켰다. 그러므로, NOX4와 TRAF6가 positive feedback 작용을 통해, 효과적인 NF-kB 활성을 조절한다는 사실을 말해준다. 본 논문에서는 TRAF6는 TNF에 의해 매개된 신호 전달 체계에서는 세포사멸을 억제하는데 있어 중요한 내부 인자임을 밝혔고, LPS에 의한 신호 전달계에서는 NOX4의 발현을 조절하고, 이러한 NOX4에 의해 자가 변형을 촉진시켜 전사 인자를 활성 시키는 조절 메커니즘을 규명하였다.;TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) is essential in mediating signals from both TNF receptor (TNFR) superfamily and interleukin-1 receptor (IL-1R)/Toll-like receptor (TLR) superfamily. TRAF6 plays a variety range of roles in the regulation of innate and adaptive immune responses. Therefore, in this present thesis, I have explored the novel functions of TRAF6 in TNF and LPS signal transduction. In PART A, I have described the connection between TRAF6 and TNFR1 signaling. TNFR1 signaling exerts both cell survival by activation of nuclear factor-κB (NF-κB) and cell death through sustaining the c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation by the accumulation of reactive oxygen species (ROS). Thus, activation of NF-κB provides a main checkpoint for keeping the balance between cell survival and death. Previous reports have shown that several molecules such as TNFR-associated factor 2 (TRAF2) and p65/RelA play pivotal roles in the inhibition of persistent activation of JNK in response to TNF. The requirement of TRAF2 as a key adaptor molecule in TNF signaling is well characterized. Other TRAFs such as TRAF5 is known to functional redundancy of TRAF2, but involvement TRAF6 is completely unclear in the TNF cascade. Here I indentified a new role for TRAF6 in antagonizing cell death during TNF signaling. Interestingly, TRAF6-deficient 3T3 (T6^(-/-) 3T3) cells are susceptible to TNF-induced toxicity, indicating that TRAF6 is required to regulate TNF-dependent signals. TNF stimulation leads to the accumulation of ROS as well as prolonged JNK and p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase activation but completely abolished ERK activation in T6^(-/-) 3T3 cells but not wild-type cells. Therefore, TRAF6 negatively modulates accumulation of ROS-mediated sustained JNK activation which in turn results in cell death. These data were supported by the evidence that elimination of ROS blocked cytotoxicity against TNF. TRAF6 is also critical for ERK activation which is not involved in resisting to cell death by TNF. Furthermore, TNF-induced p65/RelA phosphorylation and transcriptional activity of NF-κB was significantly downregulated in T6^(-/-) 3T3 cells. T6^(-/-) 3T3 cells were exhibited abnormal hyperactivation of the PI3 kinase (PI3K)-Akt pathway resulting in inactivation of glycogen synthase kinase 3β (GSK3β). Notably, LY294002, PI3K inhibitor significantly increased cell viability. Moreover, restoration of GSK3β activity through reconstitution of a GSK3β constitutive active form rescued cell death in TRAF6 null cells, suggesting requirement of GSK3β activity in cell survival. Therefore, these results demonstrate that the optimal activation of PI3K-Akt and the magnitude of GSK3β inactivation are important in cell survival signal. Although TRAF6 is associated with GSK3β, their putative binding site is not directly affected in TNF-induced cell death. Taken together, these data suggest that TRAF6 is important in TNF-induced NF-κB activation and inhibition of JNK activation which is associated with suppressing ROS accumulation to protect from cell death. TRAF6 serves as a key regulator in the maintenance of cell survival by regulating PI3K-Akt-GSK3β cascade in TNF signaling. In PART B, the role for TRAF6 has been defined in LPS signaling. This present study has shown the correlation between TRAF6 and NADPH oxidase 4 (NOX4) in LPS-induced TLR4 pathway. TLR signaling is a major center for regulation of innate immune system recognizing various microbial pathogens and helps to amplify adaptive immunity. LPS, the component of Gram-negative bacteria, initiates TLR4 signaling cascade. TLR4 triggers distinct two pathways including NF-κB- and IFNβ-mediated target gene expressions. TRAF6 activates TAK1 complex through its autoubiquitination which is a critical event to activate transcription factors, even though detail mechanism how TRAF6 facilitates self-modification is not clear. Recently, ROS generation of NOX4, which is homologues of the phagocyte NADPH oxidase subunit NOX2, is essential in LPS-induced NF-κB activation was clarified. However, the cellular mechanism that links NOX activation with receptor signaling is poorly understood. In this study, I provide the evidence that activation of NOX4 amplifies LPS-mediated signaling via enhancing TRAF6 modification. In TRAF6 deficient cells, ROS generation was impaired due to the downregulation of NOX4. The NOX4 expression level increased upon cotransfection with NOX4 and TRAF6, indicating that TRAF6 is critical for ROS production and stabilizing NOX4 expression. In addition, NOX4 interacts with TRAF6 and promotes K63-linked polyubiquitination of TRAF6 which is essential for regulation of downstream signaling. Obviously, RNA interference of NOX4 led to severe reduction of TRAF6 ubiquitination. Consistent with TRAF6 modification, NOX4-C-terminus where TRAF6 binds are sufficient to increase NF-κB activation. These data demonstrate that NOX4 is required for TRAF6-mediated NF-κB transcription in LPS-induced TLR4 signaling. In summary, these results established that a positive feedback between NOX4 and TRAF6 is crucial for efficient NF-κB transactivation responding to LPS.