Two Different Pathways for CD40 Signaling through Reactive Oxygen Species in B Lymphocytes

Abstract

CD40 is a surface receptor that belongs to tumor necrosis factor receptor (TNFR) family, and plays important roles for proliferation, differetiation, immunoglobluin (Ig) and interleukin (IL)-6 secretion isotype switching, and development of memory cells in B Iymphocytes. Engagement of CD40 induces multiple signaling pathways including protein tyrosine kinase cascade and the activation of the mitogen-activated protein kinases (tfAPKs) such as c-Jun N terminal kinase (JNK) and p38 ultimately activativating transcription factors. However, it requires further study how engagement of CD40 couples to these downstream events in B cell activation. Recent studies have suggested that reactive oxygen species (ROS) act as second messengers in the signaling pathways, activating MAPKs and transcription factors. In this study, we investigated whether ROS generation is involved in CD40-mediated signaling pathways in a murine Iymphoma, WEHI 231 and a human Iymphoma, Raji cells using a redox-sensitive fluorescence probe. We show that CD40 ligation generates ROS, and these ROS mediate in CD40-induced p38 activation in both WEHI 231 and Raji B cells. We further investigated how ROS are generated 1311owing CD40 ligation in B Iymphocytes. We focused on the role of two effector enzymes for ROS generation, NADPH oxidase and 5-lipoxygenase (5-LO). Our study using inhibitors of these effector enzymes shows that CD40 ligation couples to distinct pathways to generate ROS: NADPH oxidase in WEHI 231 and 5-LO in Raji B cells. Using dominant negative mutants for Racl, TNFR associated factor (TRAF) molecules, we also show that Racl is involved in CD40-mediated ROS generation in both WEHI 231 and Raji B cells, and that TRAF molecules, especially, TRAF 3, selectively involved in the generation of ROS in WEHI 231 B cells. We next investigated signaling molecules involved in the generation of ROS through these NADPH oxidase and 5-LO pathways in WEHI 231 and Raji B cells. We examined direct molecular interactions, if any, among signaling proteins, including CD40, TRAF molecules, p85, a regulatory subunit of P13-K, p40phox, a subunit of NADPH oxidase, and 5-LO. Our study shows that CD40 directly interacts with TRAF molecules and p85. Our study also shows p85 interaction with TRAF molecules, selectively TRAF 3, and 5-LO, as well as, p40phox interaction with TRAF 3. In conclusion, our study shows that distinct sources are involved in ROS generation following CD40 stimulation upon B cell types. We demonstrated that CD40 ligation couples to NADPH oxidase signaling pathways through TRAF 3 interaction with p40phox in WEHI 231 B cells, and that CD40 ligation couples to 5-LO signaling pathways through either a direct interaction with 5-LO or an interaction of p85 with 5-LO in Raji B cells.;CD40는 tumor necrosis factor receptor (TNFR) 계에 속하는 세포 표면 단백질로서 CD40에 의한 신호전달은 생체 면역반응에 중요한 역할을 담당한다. 특히, B 임파구에서 궁극적으로 transcription 을 조절하여 세포의 분화, 발달, 그리고 활성화 과정에 기여한다. 그러나 이러한 중요성에도 불구하고 CD40에 의한 신호체계가 B 임파구의 활성화 과정에 관여하는 기전이 아직 밝혀져 있지 않은 상태이다. 최근의 연구결과에 의하면, 다양한 수용체에 의한 신호전달 체계에서 활성 산소종이 관여된다는 보고가 이어지고 있고, TNFR 신호 체계에서 활성 산소종의 생성 및 그 중요성이 또한 보고되고 있다. 본 연구에서는 CD40 자극에 의한 신호전달 체계에서도 이러한 활성 산소종이 관여하는지를 B 임파구 세포주들인 WEHI 231 과 Raji 를 비교하여 조사하였다. 그 결과, 두 종류의 B 임파구 세포주에서 모두 CD40 자극에 의해 활성 산소종의 생성이 관찰되었고, 또한 이러한 활성 산소종이 CD40에 의한 p38, mitogen-activated protein kinase (MAPK) 활성화에 second messenger로서의 역할을 담당하고 있음을 밝혔다. 다음으로 CD40 자극이 오면 어떠한 단백질들에 의해서 활성 산소종이 생성되는지를 조사하였다. 그 결과, CD40 수용체를 통한 동일한 자극에 의한 활성 산소종의 생성기전이 두 종류의 B 임파구 세포주에서 다르게 관여하고 있음을 알게 되었다. 즉, WEHI 231 B 임파구 세포주에서는 NADPH oxidase 가 관여하는 반면, Raji B 임파구 세포주에서는 5-lipoxygenase (5-LO) 경로를 통해 각각 CD40 에 의한 활성 산소종 생성이 조절되고 있음을 밝혔다. 또한, 서로 다른 활성 산소종의 생성기전이 관련 단백질들의 상호작용에 의하여 조절되는지의 여부와 두 B 임파구 세포주에서 이들 단백질들의 발현 정도를 검사하였다. 그 결과, WEHI 231 세포주에서는 TNFR-associated factor 3 (TRAF 3) 를 통하여 CD40에 의한 신호가 phosphatidly inositol-3 kinase, p8S 및 NADPH oxidase 에 전달되어 활성산소종이 생성되고, Raji 세포주에서는 TRAF 3 발현정도가 미약하여 CD40에 의한 신호가 CD40와 직접 결합하는 p85 를 통하여 5-LO에 전달되어 활성산소종이 생성됨을 밝혔다.