Identification and expression analysis of cold responsive genes from SAGE tag sequences of Arabidopsis using GLGI

Abstract

Temperature is one of the environmental factors that has a large effect on the physiology, growth and development of plants. Increasing their cold tolerance after being exposed to low nonfreezing temperatures, a process known as cold acclimation is shown in many plants. This adaptive process involves various biochemical and physiological changes in plants. Many of these changes have been shown to be regulated through changes in gene expression. To investigate the changes of gene expression after cold treatment in Arabidopsis, SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) was performed in this laboratory. To understand the cold acclimation pathway, the tags expressed more than eight fold up or down were analyzed. First, a half of unique match tags with predicted or known functions were classified according to its function which was assigned using the MIPS (http://mips.gsf.de) analysis system. This indicated that Protein synthesis-related proteins were most highly expressed in cold treatment, whereas energyrelated proteins were present at most decreased expression level in cold stress. Second, to identify the gene in the SAGE tags with multiple matches, GLGI(Generation of Longer cDNA fragments from SAGE tags for Gene Identification)were performed with 28 out of 122 tags with multiple matches. Ten out of tile 28 clones showed unique homology to known genes in the public database, 14 were identifed as no match, and 4 were artifact that is one without a match for its SAGE tag sequence. Third, to Isolate tile 3' cDNA fragment in tile SAGE tags with no match, GLGI were performed with 19 out of 120 tags with no match. Nineteen clones with no match were identified as no match, except the 4 clones with single match, which showed unique homology to known genes in the public database. It is that no match was to single match through update of database during GLGI experiments. Most of genes which were identified to correct genes through GLGI were encoded proteins with unknown function. And to confirm the induction of those in cold stress, time course of gene expression was measured by RT-PCR. Expression time course of three genes (tag number 52, 64, 74) were early-induced under cold stress, whereas tag number 76 were lately-induced. And, CDNA clone 306, tag number L64, tag number Ll3l were lately-repressed under cold treated. These studies should contribute to fundamental knowledge of how plants improve cold tolerance and potentially provide tools that can be used to design more cold-resistant plants. And, to understand the cold acclimation pathway and to identify the genes in the rest with multiple matches or no match to GeneBank database, several different approaches should be applied in the future.;다양한 환경 조건 중의 하나인 저온 스트레스는 식물의 생육 및 번식에 결정적인 요인으로 작용하므로, 이동성이 없는 식물은 진화를 통해 이를 극복하거나 적응하는 형태, 생리, 생화학적 기작을 발전시켜 왔다. 식물이 결빙온도가 아닌 저온의 환경조건을 방지하여 이에 반응하는 것을 저온순화(cold acclimation)라고 한다. 1985년 Guy 등에 의해 저온 순화 시 저온에 의하여 유전자 발현에 변화가 있음이 확인된 이래, 저온 유도성 유전자의 분리 및 이들의 내동성 기작에서의 역할에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔다. 그 연구의 결과, 저온순화 시 발현이 유도되는 많은 수의 유전자들이 잠재적으로 내동성에 기여하는 효소활성과 연관되어 있음을 알 수 있었다. 따라서 이러한 연구는 식물의 내동성 및 저온 내성에 대한 이해를 바탕으로 경제적으로 유용한 작물들의 내성 증진을 위한 육종에 큰 진전을 유도할 것으로 기대된다. 이미 우리 실험실에서는, 애기장대에 저온처리 시 유전자 발현상의 변화를 조사하기 위해, SAGE가 실행되었다. 본 논문에서는 저온 순화 시 신호 전달 경로를 알기 위해, 8배 이상 발현이 유도되거나 저해되는 tags들이 분석되었다. 우선, 절반 가량의 unique match tags들은 MIPS analysis system을 사용하여 그들의 기능에 따라 분류를 하였는데, 단백질 합성에 관여하는 단백질은 저온처리 시 발현이 최고로 증가하는 반면, 에너지와 관련 있는 단백질은 현저히 떨어졌다. 그리고, multiple matches를 가진 28 tags에서 GLGI 방법으로 유전자를 옳게 동정하였는데, 28 clones 중 10 clones은 올바르게 unique match가 되었고, 14 clones은 no match로 동정 되었으며, 나머지 4 clones은 tag sequence가 없어서 실험결과에서 배제되었다. 또한, no match를 가진 19 tags은 GLGI 방법으로 3,cDNA 단편을 동정하였는데, no match 인 19 clones 중 15 clones은 전부 no match로 동정 되었고, 나머지 4 clones은 원래는 no match 였지만 database의 update로 인해 GLGI 실험도중 unique match로 바뀐 것 들이었다. 이번에 올바르게 동정 된 유전자의 대부분이 function 을 잘 모르는 것들이어서, 이 유전자들이 저온에 반응하여 발현 또는 억제되는지를 알아 보기 위해 시간별 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인했다. Tag 번호 52, Tag 번호 64, Tag 번호 74 세 유전자는 저온처리 시 초기에 발현양이 증가한 반면,Tag 번호 76 유전자는 후기에 발현양이 증가했다. 그리고, cDNA clone 306, tag 번호 L64, Tag 번호 Ll3l 세 유전자는 저온처리 시 후기에 발현양이 감소했다. 본 연구는 저온에 의해 발현이 유도되는 유전자를 옳게 동정하고 그 특성을 분석하여 저온에 대한 내성 기작을 이해함으로써, 식물의 저온 저항성을 향상 시키는 기반 지식으로써 활용 될 수 있을 것이다. 그리고, 앞으로는 8배 이상 발현이 유도되거나 저해되는 SAGE tags 중 multiple 이나 no matches인 나머지 tags 들의 GLGI를 통한 옳은 동정을 진행해야 하겠고, 이 논문에서 기능을 알아낸 저온 유도성 유전자와 저온 저해성 유전자의 저온 순화과정에서의 역할에 대한 연구가 이루어져야 하겠다.