Identification of gene products interacting with Rop1Vγ of mung bean using a combined experimental strategy

Abstract

많은 GTPase는 GTP의 결합과 가수 분해에 의해 '작동'과 '멈춤' 상태로 전환되는 분자적 스위치로써의 역할을 한다. GTP binding proteins은 세포 신호 전달에 있어서 cytoskeleton 배열에서부터 세포 주기 조절에 이르기까지 다양한 세포 내 과정을 조절하는 핵심적인 역할을 담당하고 있다. GTP binding proteins은 크게 heterotrimeric G protein과 small G protein으로 나누어 지는데 Small G protein은 염기 서열의 유사성 정도에 따라 크게 Ras, Rho/Rac, Ran, Arf, Rab/Ypt로 나누며 이를 통칭하여 Ras superfamily라 부른다. 이 superfamily에 속하는 Rho GTPase는 그 구조와 기능에 따라 Rho, Rac, CDC42로 구분되어진다. Rho subfamily 중 하나인 Rop (Rho-related GTPase from plant)은 식물에 존재하는 독특한 subgroup이고 주로 식물 생장과 발달 과정, 방어 기작 등에 관여하는 것으로 보고되고 있다. 본 논문에서는 Rop에 속하는 RoplVr의 세포 내 위치와 조직에 따른 발현 차이를 파악하고, 두 가지의 다른 실험적 접근을 통해 세포 내 신호 전달 과정에서 RoplVr의 partner protein을 분리 · 분석함으로써 Rop1Vr의 기능을 이해하고자 하였다. Western blot 분석을 통해서 RoplVr은 membrane과 결합되어 있고 뿌리와 줄기에서 많이 발현되는 protein임을 알 수 있었다. Rop1Vr과 결합하는 protein을 확인하기 위해서 yeast two hybrid 실험과 immunoprecipitation 실험을 수행하였다 yeast two-hybrid 실험으로부터 serine/theronine kinase, 40S ribosomal protein, tubulin beta chain, clathrin heavy chain, plasma membrane integral protein, translation initation factor, pathogen related protein, gibberellin regulatory protein, GDP dissociation inhibitor 등을 포함하는 35개의 candidate를 얻을 수 있었다. nonhydrolyzable GTPγ를 첨가 시켜 실행한 immunopreicipitation 실험으로부터 3가지의 다른 protein들이 얻어졌다. immunoprecipitation으로부터 얻어진 2개의 protein은 yeast two-hybrid 실험으로부터 얻어진 candidate의 in silico enzymatic digestion을 통해서는 정체를 파악할 수 없었으나, 나머지 한 개의 candidate는 tubulin beta chain으로 그 정체가 확인되었다. 이러한 상호 보완적 실험들을 통해서 RoplVr의 신호 전달 과정에 대한 상호 작용 map은 그릴 수 없을지라도 이러한 결과들은 RoplVr이 번역 조절, membrane recycling, cytoskeleton 조절, 방어 기작, 세포 생장 조절, 스트레스 반응 등의 역할을 할 것이라는 추정을 가능케 하였다.;Small GTP-binding proteins are divided into five groups: Ras, Rho/Rac, Ran, Arf and Rab/Ypt. The Rho families consist of Rho, Rac and CDC42. As one of Rho subfamily, Rop (Rho-related GTPase from plant) is comprised to distinct subgroup in plants and may act as a common switch in signaling to many aspects of plant growth, development, and defense response. To understand the function of RoplVr through identification of localization and isolation of the partner protein in signaling pathway, serial different experimental approaches were applied. Western blot analysis showed that RoplVr is a membrane-bound protein and preferentially expressed in roots and stems. To identify the proteins that interact with RoplVr, yeast two hybrid experiment and immunoprecipitation experiment were performed. From the yeast two-hybrid experiment, thirty five candidates including serine/threonine kinase, 405 ribosomal protein, tubulin beta chain, clathrin heavy chain, plasma membrane integral protein, translation initation factor, pathogen related protein, gibberellin regulatory protein, GDP dissociation inhibitor and etc. were isolated. From immunoprecipitation experiment in the presence of nonhydrolyzable GTP□S, 3 distinctive proteins were detected. While two proteins cannot be identified from in silico enzymatic digestion, the most prominent protein among these was assigned as a tubulin beta chain, which was also identified as a putative partner protein from yeast two-hybrid experiment. At this movement, even it is not possible to draw the interaction map for RoplVr signaling pathway, these results clearly suggest that RoplVr may play a role in translation regulation, membrane recycling, cytoskeleton regulation, pathogenesis and cell growth regulation, response to stress and etc.