Saccharomyces cerevisiae의 chitin synthase 3 조절기작에 대한 연구

Abstract

곰팡이에서 발견되는 chitin은 cell wall에서 소량을 차지하지만 cell wall의 essential component로 작용하여 septum을 형성하거나 spore cell wall의 합성 등에 중요한 역할을 담당한다. S. cerevisiae에서 보이는 세 chitin synthase 중에서, chitin synthase Ⅲ (CSⅢ)는 chitin의 대부분의 합성에 관여하고 있으며, 다른 chitin synthase와 같이 zymogen으로 존재하여 Post-translational regulation을 받는다. CHS3의 regulator인 CHS4는 CSⅢ의 activator로, 또는 protein-protein interaction에 의해 Chs3의 localization에 중요한 기능을 담당하는 것으로 제안된 바 있다. 선행연구에서 CHS4와 interaction하는 CHS3의 작용기작을 밝히기 위해 CHS4와의 interaction에 중요한 CHS3의 부분을 150 bp 정도로 좁혔는데 (MIRC3-4 : Maximum Interacting Resion of CHS3-CHS4), 이 부분이 amino acid수준에서 CHS3의 작용에 중요할 것이라는 것을 확인하였다. 이 부분에서 core residue를 찾아내기 위해 다른 yeast strain과 homology를 높게 보이는 몇 amino acid를 다른 amino acid로 치환한 Plasmid를 chs3 null mutant인 HPY3에 transformation하였다. 본 실험에서는 이들 strain에 CSⅢ activity, calcofluor resistancy, osmotic suppression 등의 functional assay를 수행하였다. 그 결과, CHS3의 663번째 amino acid인 Gln을 Met로 치환한 mutant에서 CSⅢ activity가 가장 낮게 나와서 이 부분이 core residue로 작용할 것이라는 것을 확인하였다. Calcofluor resistancy의 경우 MTRC3-4 mutaut에서 abnormal chitin이 발현되어 wild CHS3보다는 resistancy를 보이지만 HPY3보다는 sensitivity가 나타났고, osmotic suppression의 경우에는 cell wall의 대부분을 glucan이 차지하고 극히 적은 부분만을 chitin과 mannan이 차지하기 때문에 CHS3의 유무가 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. ScChs3p와 ScChs4p와의 interaction을 immunoprecipitation(IP)으로 확인하기 위해, 각각의 protein을 western blot으로 확인하였다. ScChs3p에 대해서는 ScChs3p의 N-terminal부분 1.3Kb에 대해 antibody를 제작하여 Chs3p가 있는 strain의 membrane fraction에서 170kD의 band를 확인할 수 있었고, ScChs4p는 ScChs4p에 FLAG이 tagging된 protein을 anti-FLAG을 사용하여 cytosol fraction에서 110kD의 band를 확인할 수 있었다. 이어서 ECY 36-3A와 HPY3의 membrane fraction과 Chs4p가 있는 cytosol fraction을 anti-Chs3p를 이용한 IP결과에서 Chs3p가 Chs4p와 interaction함을 확인하였다. 또한 cell cycle에서 CSⅢ 조절기작을 보기 위해서 CHS3와 CHS4의 관계를 알아보았는데, Chs3p의 양은 일정하게 나타남을 antibody로 확인했지만 선행실험의 결과에서 G_(1)에서 CHS4가 많이 transciption됨이 나타났으므로, cell cycle 동안 Chs3p는 그 양이 일정하게 유지된 상태에서 Chs4p에 의해 Post-translational되어 CSⅢ activity에 작용하게 됨을 알 수 있었다.;Chitin found in fungi is a minor component of the cell wall but essential components in the cell with functions of septum formation and spore cell wall synthesis. Of the three chitin synthase present in Saccharomyces cereuisiue, chitin synthase 3 (CSⅢ) is responsible for the synthesis of most of the chitin and exist as zymogens with two isozymes (chitin synthase Ⅰ , chitin synthase Ⅱ), which are regulated CHS4 for the regulator of CHS3 was proposed that functions as activator or helps correct localization of Chs3p by protein-protein interaction. In previous studies, to identify the regulation mechanism of CHS3 region for interacting with CHS4 was narrowed and this region was confirmed with amino acid sequence analysis. To identify the amino acid responsible for the interaction, amino acids conserved in MIRC3-4 were substituted to other amino acids and plasmid with mutated CHS_(3) was transformed to HPY3. In this studies, physiological assays contained CSⅢ activity, calcofluor resistancy, osmotic suppression were performed about this mutant strains. The mutant substituted by methionine at glutamate on 663 position expressed less CSⅢ activity? so this region functions the core region of CHS3 interacting with CHS4. For calcofluor resistancy , MIRC3-4 mutant only expressed cell wall chitin so that all of the MIRC3-4 mutant had a little calcofluor resistancy less than HPY3. Because glucan was the major component of the cell wall and chitin and mannan was the minor component? deletion or mutation of CHS3 had no effect to osmotic suppression. To identify the interaction of ScChs3p and ScChs4p using immunoprecipitation, each of the protein was identified by western blot. For ScChs3p, polyclonal antiserum was produced against 1.3 Kb contained N-terminal of ScChs3p and ScChs3p with the size of 170 kD was identified at membrane fraction. ScChs4p with the size of 110 kD was identified at cytosol fraction using ScChs4p-FLAG protein against anti-FLAG. Follow this, the immunoprecipitation of ScChs3p fraction and ScChs4p fraction was identified the interaction of Chs3p and Chs4p. For the regulation of CSⅢ through cell cycle, Chs3p was constant though CSⅢ acitvity maximized at G_(1) phase and S phase and transcription level of CHS4 was much more at G_(1) phase and S phase. Therefore constant Chs3p through the cell cycle is post-translational regulated by CHS4 and functions CSⅢ activity.