The Roles of Syndecan-4 in Cytoskeleton Formation and MAP kinase activation

Abstract

Adhesive 결합은 세포들의 migration, proliferation 그리고 differentiation 에 명백한 법칙을 갖는다. 이러한 adhesive 결합은 세포 표면에 존재하는 수용체들에 의해 형성되는데 이들 수용체들은 세포와 세포사이의 ligand와 결합하거나 extracellular matrix (ECM)와 결합하며, 또 한 세포의 생리학적인 측면에서 adhesion 에 의해 형성된 변화는 세포 내부 신호 전달 과정을 통해서 조절 되어 진다. 많은 연구자들은 ECM 의 한 종류인 Fibronectin (FN)이라는 ligand 에 대한 syndecan-4 proteoglycan 의 기능들을 세포 spreading, adhesion 그리고 MAP kinase activation 에 초점을 두고 조사 하고 있다. 이 논문에서는 Rat Embryo Fibroblast (REFs)가 서로 다른 종류의 FN substrate에 놓일 때, syndecan-4 의 효과와 역할에 대해 알아보았다. FN substrate에 놓여진 REF와 달리, HepII domain이 결핍된 FN120에 놓여진 세포들은 adhesion의 결합력이 약해졌으며, focal adhesion 이나 stress fiber 형성에 문제를 보였다. 이로써 알 수 있는 것은, FN substrate 에 존재하며, 또한 Integrin 결합 domain인 cell-binding domain과 Syndecan-4 결합 domain으로 알려진 C-terminal heparin-binding domain(HepII)이 함께 세포골격 형성을 조절 한다는 것을 알 수 있다. 또한 FN substrate에 존재하는 세포의 경우, Phosphotyrosine 염색결과 이것들은 REF 세포의 Focal contact 에서는 발견이 되나 FN120 에 존재하는 세포의 경우에는 결핍 된다는 것을 보여 주었다. 또한 전체 Tyrosine 인산화 중에서 가장 잘 알려진 Focal Adhesion Kinase (pp125FAK)의 Tyrosine 397 잔기의 인상화가 감소되는 것으로 보아서 HepII domain 으로부터 오는 adhesive 신호 전달 과정이 Focal contact 에 존재하는 분자들의 Ttyrosine 인산화 조절에 첨가적 역할을 맡는다는 것을 알 수 있다. 그러나, HepII domain 으로부터의 신호들은 adhesion-mediated MAP kinase 활성에 있어서는 아무런 영향을 미치지 못한다는 것을 알 수 있었다. 첨가적으로, HepII domain 의 수용체로 알려진 Syndecan-4를 REF 세포에 overexpression 시키게 되면 FN substrate 에 대한 세포의 spreading 과 adhesion 의 증가를 보였지만 역시 Integrin-mediated MAP kinase 활성에는 아무런 변화를 볼 수 없었다. 그렇지만 adhesion 수용체로써 작용하는 Syndecan-4 가 Growth factor-mediated MAP kinase 활성 조절을 증가시킨다는 것을 보았다. 이는 정상 Fibroblast인 REF와 Syndecan-4를 overexpression시킨 REF-Syn4 세포의 Growth factor-mediated MAP kinase 활성을 비교해 본 결과 PDGF-BB(50 ng/㎖)을 처리한 경우에 REF-Syn4 세포에서 MAP kinase 활성이 4배 증가됨을 볼 수 있었다. 이렇게 증가된 MAP kinase 활성은 Syndecan-4의 Heparan sulfate chain에 무관했으며 PI3-kinase나 pp125 FAK의 활성과도 무관 하였다. 흥미롭게도, PDGF-BB 존재 시 Stable transfected REF-Syn4 와 Transient transfected HEK293 세포에서 PDGFβ 수용체와 결합하는 SHP-2 (Src homology 2 tyrosine phosphoatase protein)의 활성과 결합이 증가하였다. 결론적으로, FN 에 존재하는 Hepll domain 과 Syndecan-4 는 Integrin-mediated cell spreading을 조절하지만 Integrin-mediated MAP kinase 활성에는 관여하지 않는다. 또한 overexpressed Syndecan-4는 SHP-2 활성과 PDGFβ수용체와의 결합을 증가시킴으로써 PDGF-mediated MAP kinase 활성을 증가 시킨다.;Adhesive interactions play critical roles in directing the migration, proliferation, and differentiation of cells. These adhesive interactions, mediate by cell surface receptors tat bind to ligands on adjacent cells or in ,the extracellular matrix, also regulate intracellular signal transduction pathways that control adhesion-induced changes in cell physiology. These studies have focused the function(s) of syndecan-4 proteoglycan on rat embryo fibroblast (REFs) cells cytoskeleton organization, adhesion, and MAP kinase activation, during cell spreading on its ligand, fibronectin (FN). In order to study the effect of syndecan-4 on cell spreading REFs were plated onto different FN substrates. In contrast to cells on FN substrate, REFs on FN120 which lacks C-terminal heparin binding domain (HepⅡ), showed less spreading; became weaker adhesion on FN, and failed to form focal adhesions and actin stress fibers. Therefore, both the cell-binding domain and the C-terminal heparin-binding domain (HepⅡ) in REF cells that bind to syndecan-4 and then cooperatively regulate cytoskeleton organization. Phosphotyrosine was present in the focal contacts of REFs on FN within30 min, but was absent in cells on FN120. Overall tyrosine phosphorylation was much less in cell lysates from cells on FN120, with decreased phsophorylation of pp125FAK on tyrosine 397, implying additional regulation of tyrosine phosphorylation by HepⅡ domain. Nonetheless, adhesion-mediated MAP kinase activity in cells on either FN or FN120 was similar. Consistently, overexpression of syndecan-4, which binds to HepⅡ domain in cell surface, enhanced cell spreading and adhesion on FN, but did not affect integrin-mediated MAP kinase activation. In contrast to adhesion-mediated MAP kinase activation, syndecan-4 regulated PDGF-mediated MAP kinase activation. Comparing to REFs, REFs overexpressing syndecan-4 core protein (REF-Syn4) showed increased MAP kinase activation by 4 fold in response to PDGF. This potentiated MAP kinase activity of syndecan-4 by PDGF was independent on heparan sulfate chains. Neither PI3-kinase nor pp125FAK activity seemed to be involved in potentiation of MAP kinase by syndecan-4. Interestingly, increased interaction of tyrosine phosphatase SHP-2 with PDGF receptor was observed in REF-Syn4. Furthermore, phosphatase activity of SHP-2 was enhanced both transiently and stably syndecan-4 transfected cells. Therefore, I conclude that both HepⅡ domain of FN and syndecan-4 regulate integrin-mediated cell spreading, but not MAP kinase activation.