Part I: Analysis of the expression of apoptosis related genes in CD8 memory T cells, Part Ⅱ: Establishment of the recombinant IL-23 expression system

Abstract

Immunological memory can be defined as the faster and stronger response of an animal that follows re-exposure to same antigen. Also. CD8 memory T cell is an important goal of vaccination because it can provides protection against re-exposure of same pathogen especially virus and intracellular infectious bacteria. The pool of memory T cells can remain stable and a balance among cell survival. apoptosis, and proliferation maintains this constancy. Memory T cells express a different pattern of cell surface marker CD62L (L-selectin)^(high) CD44^(high) compared with effector T cellsexpressing CD62L^(low) CD44^(high) and naive T cells expressing CD62L^(high) CD44^(low). To understand the long-living property of memory T cells. we compared memory T cells to naive and effector T cells in terms of differentially expressed molecules. Especially. we focused on the apoptosis-regulating molecules such as, Bad. Bid. Bak, Bim. FOXO1. FOXO3 and AIF. and measured the expression levels by semi-quantitative RT-PCR. Naive effector and memory CD8 T cells were isolated from mice infected with LCMV 7-. 40- days before the test and the cells were isolated using FACS sorter by measuring the level of CD62LCD44 surface marker. From the isolated cells. mRNA were recovered and employed as templates for semiquantitative RT-PCR. We uncovered that memory CD8 T cells express much lower levels of pro-apoptotic Bcl-2 family members (Bad. Bid. Bak and Bim). Forkhead transcription factors (FOXO1, FOXO3) and apoptosis-inducing factor (AIF) than other phases of CD8 T cells. This finding suggests that down regulation of pro- apoptotic molecules may play a role in the long-term survival of memory CD8 T cells.;PART Ⅰ : 기억 CD8T 림프구 (CD8 memory T cells)에서 의 세포사멸 관련 유전자들의 발현야상 조사 면역학적 기억(Immunological memory)은 동물에서 같은 항원에 재노출 시 빠르고 강한 반응을 의미한다. 또한 기억CD8T 림프구는 바이러스, 세포 내 감염 세균들의 재침입에 대해 방어하기때문 vaccination 의 중요한 목적이 된다. 기억 T 림프구 층은 안정하게 유지되고, 세포생존, 사멸, 증식 간의 평형으로 이러한 항상성은 유지된다. 기억 T 림프구는 원시(naive) T 림프구의 세포표면 표지인 CD62L^(high) CD44^(low), 작동 (effector)T 림프구의 세포표면 표지인 CD62^(low) CD44^(high)와 구별되는 세포표면 표지 CD62L (L-selectin)^(high) CD44^(low)를 발현한다. 우리는 기억 T 림프구의 오래 사는 성질을 이해하기 위해, 기억 T 림프구, 원시(naive)T 림프구, 작동 (effector)T 림프구의 서로 다르게 발현하는 분자들을 비교하였다. 특히 전사멸 관련유전자인 Bad, Bid, Bak, Bim.FOXOI, FOXO3.AIF에 관심을 가져, semi-quantitative RT-PCR의 방법으로 이러한 유전자의 발현수준을 측정했다 실험 7-,40-일전에 LCMV를 감염시킨 쥐(mice)에서 FACS sorter를 이용해 CD62LCD44세포 표면표지를 측정해 원시(naive). 작동(effector). 기억(memory)CD8T 림프구를 분리했다. 분리된 세포에서 mRNA를 분리해 semi-quantitative RT-PCR의 주형(templates)으로 사용했다. 이 실험에서 기억(memory) CD8T 림프구가 원시(naive). 작동(effector)CD8T림프구보다 훨씬 적은 양의 전 세포사멸(pro-apoptotic)Bcl-2 family members (Bad, Bid. Bak and Bim). Forkhead transcription factors (FOXO1, FOXO3) .apoptosis-inducing factor(AIF)를 발현하는 것을 알 수 있었다. 이러한 발견은 전사멸 분자들(pro-apoptotic molecules)의 감소가 기억 (memory)CD8T 림프구의 오래 사는 성질에 중요한 역할을 할 것임을 시사한다. PART Ⅱ 재조합 인터루킨23 (IL-23)의 발현 체계 구축 인터루킨 23은 인터루킨 12의 서브유니트인 p40과 새로이 발견된 p19간의 공유결합으로 이루어진 이성이량체 사이토카인(heterodimeric-cytokine)이다. 또한 인터루킨 23 은 IL-23R 와 IL-12Rβ1 로 이루어진 수용체를 인터루킨 12 는 IL-12Rβ1 와 IL-12Rβ2 로 이루어진 수용체를 갖는다. 인터루킨 12 와 같이 인터루킨 23 은 T 림프구의 증식과 IFN-γ의 합성을 유도한다. 반면 인터루킨 23은 인터루킨 12와 다르게 기억 T 림프구 (memory T cells) 의 증식과 인터루킨 17의 합성을 유도한다. 인터루킨 23 신호전달 통로를 연구하기위해 인터루킨 23 용합 단백질 (IL-23 fusion protein)의 발현 체계를 구축했다. P19 서브유니트의 cDNA 는 RT-PCR의 방법으로 확보했고, 이것은 p40서브유니트와 신축성링커배열 (flexible linker sequence)로 연결했다. 인터루킨 융합단백질은, 인터루킨 12 의 길항체(antagonist)로 알려진 p40 동성이량체 (p40 homodimer)의 형성을 막기위해 고안되었다. 이어서 발현구성체(expression constructs)를 293T 세포에 트렌스펙션 시켜 세포 배양 액체배지(cultrue media)에 분비케 한 후 친화력 수지(affinity resin)를 이용해 정제했다. 융합단백질 (fusion proteins )을 이용해 P13K/Akt, p38 MAPK. Erk1/2과 같은 몇몇 카이네즈(Kinases) 의 활성을 측정했다. 결과로 인터루킨 23 이 P38MAPK 과 Erk1/2 의 인산화를 유도하는 것을 확인할 수 있었고 Akt 의 인산화는 확인할 수 없었다. 반면 인터루킨 12 는 P38MAPK과 Erk1/2 의 인산화에는 아무런 영향을 미치지 못했고, Akt 의 인산화를 유도했다. 이러한 결과로 재조합 인터루킨 23 이 기능을 할 수 있는 것을 알 수 있었고, 인터루킨 12와 서로 다른 시호전달 통로를 가지고 있음을 알 수 있었다.