암전이와 관련된 단백질의 대량 탐색 및 Heat shock에 의한 세포의 Invasion 변화 연구

Abstract

암세포의 전이 (metastasis)는 일차 종양세포가 주변 세포의 기저막을 분해하여 혈관순환계를 따라 발암지점으로부터 먼 곳으로 이동하여 분열, 성장하는 현상으로, 암 진행 말기에 주로 일어나며, 암으로 인한 사망률의 가장 큰 원인이다. 암세포가 전이되는 과정에서 중요한 단계는 일차발암조직 주변 세포 및 새로운 모세혈관을 형성하기 위한 혈관내피세포 기저막이 효소에 의해 분해되는 과정으로, matrix metalloproteinase (MMPs)가 암전이 및 혈관신생(angiogenesis)과 관련해서 중요하게 연구되고 있는 효소이다. MMPs는 현재까지 19개 정도가 보고되어 있는 zinc-dependent endopeptidase로 그 기질 특이성, 구조, 세포내 위치에 따라 크게 5종류로 분류된다. 그 중에서 비교적 기질 특이성이 넓은 gelatinases (MMP 2, 9)가 특히 암전이와 혈관신생에 관련되어 임상적인 가치가 부각되고 있다. 본 연구에서는 사전 예비실험을 통해 invasion potential의 차이 및 MMP 2와 MMP 9의 발현 양상이 다른 3가지 폐 세포주를 선별하여, invasion assay를 통한 세포내 이동, 침투성과 MMPs의 상관관계를 규명하였고, 그 결과 MMP 9 발현보다는 MMP 2 발현이 세포의 이동, 침투에 결정적임을 알아냈다. 이 결과는 인간의 태반혈관내피세포인 HUVECs (Human umbilical vein endothelial cells)에 가장 잘 알려진 혈관신생촉진인자인 VEGF (Vascular endothelial cell grown factor)처리시 세포의 이동, 침투성이 증가되었고, 이때 MMP 9활성과는 무관하게 MMP 2활성이 증가됨을 보인 실험으로도 재확인 되었다. 또, invasion potential의 차이 및 MMPs 발현양상의 차이와 각각의 폐세포주에 의해 차별 발현되는 단백질과의 상관성을 확인하기 위해, 세포안 단백질뿐만 아니라, 세포밖으로 분비되는 단백질을 proteomics 방법을 이용해 관찰하였다. 이와 더불어, 세포주에서 뿐만 아니라 환자 시료에서 암전이와 관련성이 있는 단백질을 찾기 위해, 폐암 환자의 조직을 proteomics를 이용해 동일한 실험을 진행했고, 그 과정에서 stress-induced protein인 HSPs (Heat shock proteins)의 발현양상이 정상조직에 비해 높음을 관찰하고, 이에 대한 실험을 계속 진행했다. HSPs (Heat shock proteins)은 여러 기원의 malignant human tumor에서 빈번히 발현되는 단백질로 heat shock 또는 감염, 저산소 상태, 중금속, 산화적스트레스 등에 의해 유도 발현되는 ATP-dependent molecular chaperone으로 초기 polypeptide의 folding과 assembly, 단백질 수송과 분해 등에 관여하며 stress에 의해 손상 받은 단백질이나 misfolding된 단백질을 재건하는데 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 암전이와 연관되어 많이 연구되고 있는 HSPs 중 HSP 70에 중점을 두고, 실험적으로 HSP 70을 과발현 시키기 위한 유도체로 heat shock (열처리)과 hypoxia (저산소 상태 CoCl_(2))처리를 했고, HSP 70 과 발현시 MMP 2 및 MMP 9의 발현양상의 차이를 관찰했으며, 이때의 invasion assay를 통한 세포의 이동, 침투성을 확인했다. 또, 이미 HSP 70가 과발현되어 있는 세포인 TR-RIF-1과 control 세포인 RIF-1으로 동일한 실험을 진행한 결과, HSP 70 과발현시 활성형의 MMP 2 활성이 감소함을 알아냈고, 그 결과 세포의 이동, 침투성이 감소함을 알 수 있었다. 이런 일련의 실험을 통해 본 연구에서는 세포에 stress로 처리한 heat shock에 의해 암세포 전이와 관련되어 중요한 효소인 MMP 2 활성이 저하되었고, 이로 인해 세포의 이동, 침투성이 현저히 감소함을 규명하였다. 이 결과는 정상조직에 비해 암조직에서 heat shock proteins이 과발현 되어 있고, 이것이 암세포 전이와 관련하여 중요한 역할을 할 것이라는 가설에 비추어 보아, HSPs 과발현시 세포의 이동, 침투성이 증가 될 것이라 예상하였으나, 결과는 그 반대로 나타났다. 이는 molecular chaperone 인 heat shock proteins의 증가는 세포가 암화되어 성장, 분화하면서 외부 환경변화에 대한 자기 방어체계중의 하나로 원래 세포 상태로의 항상성 유지에 필요한 단백질임을 추측 해 볼 수 있었는데, 이런 추측은 세포내 HSPs을 transfection방법을 이용해 과발현 시켜 동일한 실험을 진행 해 더 연구해 봄으로써 밝혀야 할 부분이라고 생각되어 실험을 진행중이며, 이 실험결과는 HSPs 과발현과 암의 전이에 있어서 세포의 이동, 침투성의 상관관계를 명확하게 해 주는 좋은 단서가 되리라 생각된다.;The occurrence of metastases is the hallmark of cancer. Tumor cell metastasis is complex and multiple processes in which tumor cells detach from the primary tumor, invade surrounding tissue and basement membranes, intravasate into blood circulation and finally adhere and extravasate in distant organs to form a secondary tumor. Dissemination of tumor cells is the principal cause of mortality in tumor patients. Degradation and remodeling of the extracellular matrix and basement membranes by proteolytic enzymes are essential steps in these processes. Among proteolytic enzymes, especially the matrix metalloproteniases (MMPs) have been the subject of most extensive research implicated in tumor invasion and metastasis. The MMPs are a family of highly conserved zinc-dephendent endopeptidases. To date, at least 19 different human MMPs have been cloned and characterized. According to their structure, substrate specificity and cellular localization, they can be classified into five different subgroup. Recent findings have indicated that MMPs, particularly gelatinase A (MMP 2) and B (MMP 9), play a central role during tumor metastasis and angiogenesis. In this study, three lung cancer cell lines having different MMP 2 and 9 activity had been adopted to examine the different invasion capacity by invasion assay, The result show that MMP 2 activity was pivotal role in cell Migration and invasion rather than MMP 9 activity. This result proved to be reproducible when HUVECs were treated with angiogenic factor such as VEGF, cell's migration and invasion were increased at that time MMP 2 activity was increased not related with MMP 9 activity. To ensure possible relation between the different MMPs expression and different cell's invasion, we investigated the intracellular proteins and secreted extracellular proteins of three lung cancer cell lines using2-dimensional electrophresis and MALDl-TOF-MS. In addition, we also identified differentially expressed protein in tumor specimens from patients with lung cancer. We found that heat shock proteins were over expressed in tumor tissue rather than normal tissue. So, we hypothesized that HSP_(s) may influence the metastatic tumor process and investigated whether or not HSPs contributes to tumor invasion and angiogenesis. Among the HSPs, especially HSP 70 was associated with tumor invasion and metastasis. HSPs were molecular chaperones to protect cells from environmental stress damage by binding to partially denaturated proteins, dissociating protein aggregates and regulating correct folding and to cooperate in transporing newly synthesized polypeptides to the target organelles. HSPs were induced by heat shock, inflammation, hypoxia, oxidative stress and heavy metals. Thus heat shock and hypoxic mimic agent (CoC_(12)) were adopted to overexpress heat shock proteins. Heat shock at 45℃ and CoC_(12) treatment suppressed the MMP 2 activation and inhibited the invasion activity of lung cancer cell. This result indicated that heat shock preferentially suppressed the production of MMP 2 and thereby inhibited tumor invasion. To ensure that the reduction of MMP 2activity by heat shock was related to decrease in cell's migration and invasion, mouse fibrosarcoma cell line (RIF-1) and it's thermotolerant cell line (TR-RIF-1) and HUVECs were used for investigating the cell's invasion by heat shock. These results reproducible that the HSP 70 overexpression induced by heat shock was negatively associated with MMP 2 activity and cell invasion capacity. In summary, our findings indicated that HSP 70 overexpression by heat shock decreased in vitro invasiveness of lung cancer and in part by inhibiting active form MMP 2 production. Pother studies were needed to elucidated the mechanism by which HSP 70 overexpression by heat shock inhibited tumor Invasion.