애기장대(A.thaliana)에서 활성산소종에 대한 대상 단백질체의 분리 및 특성 연구

Abstract

활성산소종은 식물의 생장, 발달 및 저항성 유도등에 중요란 역할을 한다. 본 연구는 애기장대 (Arabidopsis thaliana)를 이용하여 식물의 주요한 생장조절 물질로 알려진 inodole-3-acetic acid와 Methyl Jasmonate로 부터 유도되는 활성산소종 (Reactive Oxygen Species; ROS)에 의해 조절되는 대상 단백질체를 MALDI-TOF-MS 분석 기법을 도입하여 밝혀내고 그 기능을 알아내고자 하였다. 활성산소종을 생성하는 auxin과 methyl jasmonate에 의하여 영향받는 물질을 탐색하기 위하여 Biotin이 표지된 iodoacetamide (biotin labored iodoacetate, BIAM)을 이용하여 Thiazole biosynthetic enzyme precursor, Quinine oxido-reductase-like protein, Cytosolic phosphoglycerate kinase, prydoxal kinase-like protein SOS4, Putative protein with poly glutamic acid stretch, Auxin responsive GH3-like protein, Putative rubisco subunit-binding protein alpha subunit, 2-Cys peroxiredoxin-like protein, Ribulose bisphosphate carboxylase, UDP-N-acetyl glucosamine-O-acyltransferase like protein,33 kDa polypeptide of oxygen-evolving complex, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase-like protein 을 분석했다. 위의 후보 대상 물질 중 early auxin responsive GH3-like protein은 knock out mutant을 쉽게 구할수 있었고 auxin의 생성과 관련해 다양한 신호전달과정에 배개될 수 있는 가능성을 가지고 있어서 이것을 선택해 Arabidopsis에서 대상 단백질체의 기능을 밝혀내기 위한 실험을 하였다. GH3-like knock out mutant는 초기에 활성상소종의 생성량이 높았으며 이런 과다의 활성산소종이 병원균에 대한 자신의 보로능력을 더욱 강하게 하는 효과를 보였다. 따라서 GH3-like knock out mutant의 과다의 활성산소종 다른 대상물들과 어떻게 상호 작용하는지 알아내기 위해 wild type과 비교하여 과잉발현 되어있는 단백질을 분석하였다. GH3-like knock out mutant에서 salt stress, heat shock등과 같이 환경조건이 나빠질 때 발현량이 증가된다고 알려져 있는 단백질들이 이미 wild type 보다 과잉발전 되어있었다. 또한 GH3-like knock out mutant에서는 외부에서 처리한 auxin에 의한 뿌리의 생장증가율의 감소하였고 중력 자극시(gravistimulatlon) 활성산소종의 편재된 상태에 따른 굴중성 (gravitropism)의 반응 또한 감소를 보여 자극에 대한 반응의 정도가 미약함을 알 수 있었다. 여러 자극에도 불구하고 GH3-like knock out mutant 둔감한 반응이 자극에 의해 유도되는 활성산소종과 어떤 연관이 있는지 조사하기 위해 식물체의 원형질체를 사용하여 auxin과 병원균을 처리한 뒤 그에 따른 활성 산소종의 생성 양상을 살펴보았다. 결과 GH3-like knock out mutant의 경우 IAA를 처리하거나 Pseudomonas syringae의 접종시 그로 인한 활성산소종의 생성능력이 떨어졌다. 즉, Arbidopsis의 GH3-like knock out mutant는 활성산소종의 생성과 관계된 단백질들이 이미 과발현 되어있어서 높은 수준의 활성산소종을 가지고 있었다. 결과 높은 수준의 활성산소종은 각종 자극에 의한 활성산소종의 생성반응을 감소시켰다. ;The reactive oxygen species (ROS) were generally cytotoxic molecules. High concentration of ROS are able to damage cellular components, such as nucleic acids, lipid, and proteins, causing central damage of cell indiscriminately. Several lines of evidence indicate that extracellular stimuli (Auxin, Me-Ja, etc) have been shown to induce a transient increase in intracellular concentration of ROS. Moreover, another stimuli (microbial infection, UV, and drought) also stimulate the generation of ROS in plant cells to adopt a harsh environment. These ROS mediate the induction of systemic acquired resistance response to pathogens. Therefore, ROS plays an important role in overall plant growth, development, and regulation of resistance. Recently, a procedure for detecting ROS-sensitive proteins that contain active cysteine residues was developed. There, to detect the characterization of ROS target molecules, we used biontin-conjugated iodoacetamide(BIAM). The procedure is based on the facts that ROS and BIAM selectively and competitively react with cystein residues that exhibit a low pKa, and that the decrease in labelling of cell lysate protein with BIAM caused by prior exposure of cell to ROS or to an agent that induces ROS production can be monitored by streptavidin blot analysis. We found several target proteins. Among them, we investigated with auxin early responsive GH3-like protein whether it involved in ROS-mediated plant growth, gravitropic response and resistance against pathogens in Arabidopsis. The GH3-like knock out mutant had the high level ROS and the rise of ROS level by IAA and pathogen is decreased, The Higher concentration of ROS provided pre-defenses and protection against the many challenges of a harmful environment in GH3-like knock out mutant. The GH3-like knock out mutant is the overexpressed stress-related proteins as compared with wild type. Therefore, ROS is supposed to improve plant stress tolerance. The results in this research indicate that appropriate ROS is as a second messenger in plant development.