Molecular cloning and analysis of the cDNA for Rho, a small GTP-binding protein, from mung bean

Abstract

Small GTP-binding protein은 염기서열의 유사성정도에 따라 크게 Ras/Ras-like, Rho/Rac, Ypt/Rab, Ran/TC4, Arf/Sar subfamily로 나누며 이를 통칭하여 ras superfamily라 부른다. 이 superfamily에 속하는 유전자들은 GTP-binding이나 hydrolysis에 관여하는 공통적인 sequence motif 뿐 아니라 각 subfamily에 특징적인 sequence motif를 가지고 있는데. 이를 Gl-G5 (Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, E)라 부르며, 동물, 식물, yeast를 포함한 모든 생물에서 매우 잘 보존되어 있다. 이 논문의 주제에 해당하는 Rho family에 속하는 단백질은, 다양한 생물체의 actin cytoskeleton과 관련된 많은 세포과정의 조절에서 핵심적인 역할을 담당하고 있는 것으로 보고되고 있다. 동물과 yeast세포의 Rho 단백질의 경우, 그 유전자의 분리나 기능연구가 크게 진척되어 있는데 반해, 분리된 식물의 Rho 단백질 유전자는 상대적으로 적으며 그 정확한 기능은 거의 알려진 바 없다. 식물세포에서의 Rho protein을 연구하기위한 첫단계로서 genomic DNA PCR로 얻은 rho gene fragment를 탐침으로 하여 녹두의 cDNA library로 부터 rho 유전자를 분리해냈다. 이 유전자의 염기서열을 파악하고 그 특성을 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 녹두의 cDNA library로 부터 얻은 cDNA clone은 582 bp의 ORF를 지니며, 194개의 아미노산 (분자량 약 21 kD)으로 이루어진 단백질을 암호화하는 유전자이다. 이 유전자로 부터 추론된 아마노산 서열은 small GTP-binding protein들에 잘 보존되어 있는 영역들(G1-G5)을 지니는데, 그 중 G2영역(Effector-binding domailn)과 C-말단의 CAAL motif가 이 유전자가 Rho family에 속하는 단백질을 암호화함을 시사한다. 실제로, 그 아미노산 서열로 볼 때, 밝혀진 Rho 단백질과 그 유사성이 가장 높은데, 특히 식물에서 근래에 밝혀진 Rop 계열의 단백질과 그 유사성이 가장 높다. 분리된 유전자는 rho1Vr이라 이름지었다. 2. Northern 혼성화 분석을 통해 볼 때 rho1Vr의 전사체들은 약 1,100개의 뉴클레오타이드로 이루어진다. 또한 genomic Southern blot의 결과는 염기서열분석과 함께 녹두에서의 rho gene이 family로 존재함을 보여준다. 3. rho1Vr 유전자의 기능을 연구하기 위하여, RHO 유전자 돌연변이로 인한 yeast의 증식 저해를 이 유전자가 보상해 낼 수 있는가를 조사하였는데, 결과적으로 Rho 단백질이 yeast내에서 의도대로 과도발현되었다고 가정할 때 rho3, cdc42 돌연변이체의 증식정도를 회복시켜 주지 못한다고 할 수 있다. 시험된 CDC42가 yeast의 RHO gene들 중 rho1Vr과 가장 유사하지만, 시험되지 않은 다른 RHO 유전자 돌연변이체에 대한 비슷한 보상실험이 행해져야 한다. Yeast의 RHO 유전자들이 rho1Vr과의 homology 정도에 있어 다른 식물들의 rho 유전자들에 비해 비교적 크게 낮은 점(특히, C-말단쪽의 아미노산 서열)과 rho1Vr과 식물의 몇몇 rho-related gene들이 식물의 pollen 성장의 actinomyosin motor system에 관여할 것이라는 연구결과로 볼 때 분리된 rho1Vr이 식물에 특이적인 기능에 기여할 가능성도 매우 높다.;Small GTP-binding proteins are divided into five groups : Ras/Ras-like, Rho/Rac, Ran/TC4, Arf/Sar and Ypt/Rab. These proteins contain several well conserved regions designated G1 to G5 (Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and E) that are important in GDP/GTP exchange, GTP-induced conformational change and GTP hydrolysis. The Rho family consists of Rho, Rac and Cdc42 families in animals and yeasts, and is believed to be involved in modulation of many cellular processes related to the actin cytoskeleton. In this study, putative rho gene was isolated from mung bean cDNA library and characterized. This gene was named as rho1Vr, as the five conserved regions (G1-G5) of small GTP-binding proteins, and its effector-binding domain and CAAL motif in C-terminus suggest that it belongs to Rho family. The deduced amino acid sequences of rho1Vr are very similar to the products of rho-related or rac-like genes of other plants such as RACl3 of cotton plants, Rop1Ps of peas and Rop1Bv of sugar beets. The transcripts of rho1Vr are about 1,100 nt long and this gene is likely to exist as a member of multigene family. In complementation test for understanding the functions of rho1Vr, rho1Vr couldn't complement the defects of rho3 and cdc42 yeasts. Even though the other yeast RHO genes are need to be tested, it is likely that rho1Vr might have plant-specific functions controlling actin cytoskeleton, irrelevant to yeast one.